巴豆發酵品與生巴豆、巴豆霜中毒性成分的含量比較Δ

劉春美，吳曉峰，潘 揚，蔣亞平，張 弦（南京中醫藥大學藥學院，南京市 210029）

巴豆（Crotonis Fructus）為大戟科植物巴豆Croton tiglium L.的成熟果實，載于現行《中國藥典》中[1]。巴豆大毒，其毒性主要為兩類成分，一類是脂肪油（巴豆油），含量達60%，既是毒性成分又是有效成分，口服后在腸內析出游離巴豆酸，使腸道分泌和蠕動增強，產生峻瀉；另一類是蛋白質（巴豆毒素），能溶解紅血球，使局部細胞壞死[2，3]。由于遇熱可使這兩類毒性成分含量降低或變性失活，因此目前通常采用取仁通過蒸、煮制熟后去油制霜（巴豆霜）的炮制方法，對緩和巴豆的毒性有積極意義[4，5]。但傳統炮制法操作較煩瑣，霜內含油量多少均憑經驗觀察，各地結果不一，差距很大，無法保證用藥安全[6]。在應用巴豆制品治病的過程中，由于其有效劑量與中毒劑量比較接近，安全系數低，在無血藥濃度監測的情況下，如用之不當或服用過量，不但起不到藥物應發揮的作用，有時反而還可能引起中毒甚至有生命危險[7，8]。鑒于炮制對巴豆減毒存在的缺陷，有必要尋找新的解決這類問題的好途徑。

“雙向發酵”是南京中醫藥大學藥用菌與中藥生物技術研究所創立的一種使藥用真菌與藥材間組合進行固體發酵的方法[9]，它為毒性中藥減毒開辟了一條新途徑[10，11]。本試驗對靈芝菌與白僵菌2種巴豆發酵品與生巴豆及傳統炮制品（巴豆霜）中毒性成分總蛋白和脂肪油含量及主要成分的含量進行比較，結果表明，巴豆經靈芝菌和白僵菌發酵后，其毒性成分脂肪油和總蛋白的含量明顯降低，且均低于巴豆霜；經氣相色譜-質譜（GC-MS）分析，巴豆發酵品、生巴豆和巴豆霜的脂肪油中共鑒定出48種成分。與生巴豆相比，2種發酵品脂肪油成分的組成和相對含量產生了明顯變化；且出現了新成分，其中靈巴菌質和白巴菌質中各有5種。以上結果可為發酵對巴豆的“去毒存效”奠定物質基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 6890N型GC儀、5973N型MS檢測器、7683 serise自動進樣器、Agilent色譜工作站配NIST05標準MS檢索庫（PaloAlto，CA，USA）；UV-2401紫外分光光度計（日本島津公司）；AE 240電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；HH-4數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；202型臺式恒溫干燥箱（上海索譜儀器有限公司）；THZ-D臺式恒溫振蕩器（太倉市實驗設備廠）。

1.2 試藥

生巴豆產自云南，經南京中醫藥大學陳建偉教授鑒定為大戟科植物C.tiglium L.的果實，標本保存于南京中醫藥大學藥用菌與中藥生物技術研究所（批號：20081145）；牛血清白蛋白（BSA，美國Sigma公司進口分裝，批號：A8010）；考馬斯亮藍G-250（美國Amresco公司進口分裝，批號：0615）；95%乙醇、磷酸均為分析純。

1.3 菌種

靈芝菌[Ganoderma lucidum（Curtis：Fr.）P.Karst.]和白僵菌[Beauveria bassiana（Bals.）Vuill]均由南京中醫藥大學藥用菌與中藥生物技術研究所分離、貯藏和復壯。

2 方法

2.1 試液的配制

2.1.1 考馬斯亮藍G-250溶液的制備[12]精密稱取考馬斯亮藍G-250 100 mg，加入95%乙醇50 mL，再加入85%（W/V）磷酸100 mL，用蒸餾水定容至1 000 mL，即得。2.1.2 牛血清白蛋白標準貯備液的制備 精密稱取牛血清白蛋白100 mg，用少量蒸餾水溶解并定容至1 000 mL，即得濃度為0.1 mg·mL-1的牛血清白蛋白標準貯備液。

2.2 靈巴菌質和白巴菌質的制備

按固體發酵的生產工藝進行操作[13]。將生巴豆（果實）粉碎成粗粒（過10目篩），加適量水濕潤，填裝試管，混合均勻，扎口，121℃高壓滅菌50 min，冷卻；從菌種斜面上分別切取綠豆粒大小的靈芝菌和白僵菌菌絲體（帶培養基）各1塊，移入待發酵生巴豆的表面（使二者有接觸），扎口，置培養箱中，于（27±2）℃下恒溫培養，發酵30 d后分別掏取試管中的發酵物，60℃下干燥4～6 h，即分別得靈巴菌質和白巴菌質。

2.3 脂肪油含量測定

取上述各巴豆樣品粗粒2 g，粉碎成粗粉（過20目篩），分別精密稱定，置索氏提取器中，加乙醚100 mL，水浴回流提取至脂肪油提盡（約8 h），收集提取液，置已干燥至恒重的蒸發皿中，于水浴上低溫揮去溶劑，100℃干燥1 h，移至干燥器中冷卻30 min，精密稱定，計算樣品中脂肪油含量[1]。

2.4 總蛋白含量測定[12]

2.4.1 標準曲線的制備 精密吸取牛血清白蛋白標準貯備液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置10 mL刻度試管中，先用蒸餾水補足體積至1 mL，搖勻，加入考馬斯亮藍G-250顯色劑5 mL，混勻，放置5 min。然后以第一份為空白對照，于593 nm波長處測定吸光度。以濃度（c，mg·mL-1）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，制備標準曲線，計算得回歸方程為A＝6.990 89c－0.000 91（r＝0.999 6）。結果表明，總蛋白濃度在0.02～0.10 mg·mL-1范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.4.2 樣品含量測定 精密稱取各樣品0.5 g，置50 mL容量瓶中，加20 mL蒸餾水，置震蕩器中震蕩提取2 h（150 r·min-1），3 600 r·min-1離心10 min，濾過，濾渣再加20 mL蒸餾水，置震蕩器中震蕩提取1 h（150 r·min-1），3 600 r·min-1離心10 min，合并濾液，定容至50 mL容量瓶中，即得樣品溶液。精密吸取各樣品溶液1.0 mL，按“2.4.1”項下方法操作，于593 nm波長處測定吸光度，代入標準曲線計算出樣品中總蛋白含量（%）。

2.5 脂肪油的GC-MS測定

2.5.1 儀器工作條件 色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度：250℃；載氣：氦氣（純度99.99%），流速：1.0 mL·min-1；分流模式進樣，分流比為20∶1；程序升溫：初始溫度設定為50℃，以5℃·min-1升至210℃，維持3 min，再以5℃·min-1升溫至250℃，維持5 min。質譜電離方式：EI源；離子源溫度：230℃；四級桿溫度：150℃；接口溫度：280℃；溶劑延遲時間：2.5 min；電子倍增器電壓：1 623 V；質量掃描范圍：m/z 40～500。

2.5.2 樣品的GC-MS分析 精密稱取巴豆油70 mg，加6 mL硫酸-甲醇（1∶10）混合溶液，于60℃水浴回流4 h（甲酯化），加10 mL水使樣品液冷卻，再加6 mL正己烷振蕩萃取，分離上清液，過濾，無水硫酸鈉干燥，低溫濃縮至干。殘渣加丙酮使溶解并定容至10 mL，有機相針式濾器（13 mm×0.45 μm）過濾，低溫密閉保存。取樣品溶液1 μL，按儀器工作條件注入色譜儀進行測定；對各樣品總離子流圖中化學色譜峰通過GC-MS分析工作站NIST標準圖庫進行檢索并參照有關文獻[14，15]進行初步鑒定，按峰面積歸一化法計算各組分相對百分含量。

3 結果

3.1 脂肪油和總蛋白的含量測定

各樣品中脂肪油測定結果表明：生巴豆＞巴豆霜＞靈巴菌質＞白巴菌質；總蛋白測定結果表明：生巴豆＞巴豆霜＞白巴菌質＞靈巴菌質。提示巴豆經靈芝菌和白僵菌發酵后，其毒性物質脂肪油和蛋白質的含量明顯降低，且均低于巴豆霜，詳見表1。

表1 生巴豆、巴豆霜、靈巴菌質和白巴菌質中脂肪油與總蛋白含量測定結果Tab 1 Fatty oil and total protein contents in crude C.tiglium，defatted C.tiglium seed powders，LBJZ and BBJZ

3.2 脂肪油成分的GC-MS分析

GC-MS分析結果顯示，從生巴豆、巴豆霜、靈巴菌質、白巴菌質中分別鑒定出39、24、36、42種成分，其中歸一化相對含量＞1%的共有16種化合物：生巴豆占11種，巴豆霜有12種，靈巴菌質占8種，白巴菌質占13種。在2種發酵品中還發現有新出現的成分，其中靈巴菌質有5種，分別為4-癸烯酸甲酯、十五酸甲酯、7，10-十六碳二烯酸甲酯、7-十六碳烯酸甲酯、（Z）-9-十六碳烯酸甲酯；白巴菌質也有5種，分別為壬醛、4-癸烯酸甲酯、十四烷酸、十五酸甲酯、7-十六碳烯酸甲酯。而生巴豆中的十九（烷）酸甲酯則未在發酵品中發現。各樣品脂肪油GC總離子流圖見圖1；各成分定性定量分析結果見表2。

圖1 各樣品脂肪油GC的總離子流圖（峰號參照表2）A.巴豆；B.巴豆霜；C.靈巴菌質；D.白巴菌質Fig 1 TIC of GC chromatograms of Fatty oil of samples（peak number referring to table 2）A.crude C.tiglium；B.defatted C.tiglium seed powders；C.LBJZ；D.BBJZ

表2 生巴豆、巴豆霜、靈巴菌質和白巴菌質脂肪油成分的定性定量分析結果Tab 2 Qualitative and quantitative analysis of the fatty oils in crude C.tiglium，defatted C.tiglium seed powders，LBJZ and BBJZ

續表2Continued tab 2

4 討論

巴豆經靈芝菌、白僵菌雙向固體發酵后，其毒性成分脂肪油與總蛋白含量均有所下降，且低于巴豆傳統炮制品巴豆霜。所得脂肪油甲酯化后經GC-MS法分析結果表明，靈巴菌質和白巴菌質與生巴豆及其炮制品相比，無論在脂肪油成分種類還是相對含量上均存在一定差異。這為進一步探討巴豆發酵品“去毒存效”的物質基礎提供了科學依據。至于巴豆中脂肪油與蛋白質組成成分變化同其藥效之間的相關性及其生物轉化的機制有待于進一步研究。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：74-75.

[2] 夏麗英.現代中藥毒理學[M].第1版.天津：天津科技翻譯出版公司，2005：204.

[3] 江蘇新醫學院.中藥大辭典（上冊）[M].第1版.上海：上海科學技術出版社，1977：503.

[4] 徐楚江，葉定江.中藥炮制學（供中藥專業用）[M].第1版.上海：上海科學技術出版社，1985：176.

[5] 張靜修，王 毅.生、熟巴豆對比實驗[J].中藥材，1992，15（9）：29.

[6] 天津市藥材公司中藥研究室.巴豆霜制法的研究[J].中草藥通訊，1974，3：27.

[7] 時霄霄.巴豆過敏性休克1例[J].中國中藥雜志，1994，19（9）：569.

[8] 孫云成.腹腔注入巴豆冰片液致死1例[J].北華大學學報（自然科學版），1994，14（2）：4.

[9] 莊 毅，潘 揚，張李陽，等.藥用真菌“雙向發酵”的起源、發展及其優勢與潛力[J].中國食用菌，2007，26（2）：3.

[10] 涂 霞，潘 揚.雙向發酵——毒性中藥炮制減毒的新途徑[J].菌物研究，2010，8（1）：52.

[11] 王身艷，潘 揚，蔣亞平，等.雙向發酵對川烏指紋圖譜及烏頭堿類成分含量的影響[J].中國藥房，2010，21（39）：3 712.

[12] 趙英永，戴 云，崔秀明，等.考馬斯亮藍G-250染色法測定草烏中可溶性蛋白質含量[J].云南民族大學學報（自然科學版），2006，15（3）：235.

[13] 徐錦堂.中國藥用真菌學[M].第1版.北京：北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社，1997：230.

[14] 胡 靜，高文遠，凌寧生，等.巴豆和巴豆霜揮發性成分的GC-MS分析[J].中國中藥雜志，2008，33（4）：464.

[15] 梁 英，潘英明.巴豆種子油的GC-MS分析[J].光譜實驗室，2002，19（6）：748.