櫛孔扇貝血細(xì)胞數(shù)量變化與生長的關(guān)系*

林聽聽,邢 婧,蔣經(jīng)偉,戰(zhàn)文斌

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,山東青島266003)

貝類缺乏免疫球蛋白和淋巴系細(xì)胞,其免疫防御功能主要依賴于與天然免疫有關(guān)的細(xì)胞免疫和體液因子免疫[1]。參與細(xì)胞免疫的細(xì)胞為血細(xì)胞,它是貝類抵御外來病原和環(huán)境刺激的主要“屏障”。血細(xì)胞主要通過吞噬、氧化殺傷、結(jié)節(jié)形成、細(xì)胞凝塊、黑化等過程起到免疫防御作用;此外其還通過釋放各種活性因子輔助調(diào)理體液因子免疫;以及參與貝類的營養(yǎng)運輸、傷口修復(fù)、貝殼礦化、消化排泄等各項生理活動[2-4]。因此,血細(xì)胞在貝類的免疫防御和生理功能中起著關(guān)鍵作用。

國內(nèi)外眾多研究表明貝類受外來病原和環(huán)境刺激時,其血細(xì)胞總數(shù)會發(fā)生顯著變化[5]。如貽貝(Mytilus edulis)經(jīng)Cu2+[6]、浪蛤(Mactra veneriform is)經(jīng)低溫[7]、扇貝(Chlamys farreri)經(jīng)鹽度[8]和饑餓[9]等外來脅迫時,其血細(xì)胞總數(shù)均會驟減。此外,還有研究表明貝類的血細(xì)胞總數(shù)會因食物豐度、生長和繁殖周期等呈現(xiàn)出節(jié)律性變化。如Duchemin等[10]發(fā)現(xiàn)牡蠣(Crassostrea gigas)在繁殖前期血細(xì)胞總數(shù)大、吞噬力強(qiáng)、死亡率低;而在繁殖期,血細(xì)胞總數(shù)特別低、吞噬力弱、死亡率高;Carballal等[11]研究發(fā)現(xiàn)貽貝(Mytilus galloprovincialis)在食物豐度高的季節(jié),生長旺盛,對應(yīng)的血細(xì)胞總數(shù)較高;在適宜的水溫,其血細(xì)胞總數(shù)明顯高于過低和過高的水溫。綜合以上的研究,血細(xì)胞數(shù)量變化與貝類生理和免疫防御反應(yīng)密切相關(guān)。

櫛孔扇貝(C.farreri)是我國北方沿海重要的經(jīng)濟(jì)貝類之一,形成規(guī)模化養(yǎng)殖已有將近30 a的歷史,然而近10 a來由于養(yǎng)殖環(huán)境的老化,病原體的侵襲以及扇貝種質(zhì)及抗病力的衰退,櫛孔扇貝夏季大規(guī)模死亡現(xiàn)象時有發(fā)生[12-16]。本文對不同地區(qū)、不同品種間的櫛孔扇貝在生長過程中血細(xì)胞數(shù)量的變化進(jìn)行監(jiān)測,以期為了解血細(xì)胞在扇貝生長發(fā)育中的作用以及扇貝健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 櫛孔扇貝的采集

于2009年3月至2010年1月,每月中旬從青島和威海2地分別采集人工養(yǎng)殖和野生的櫛孔扇貝(Chlamys farreri)樣品。各采樣點、各時期的扇貝分別隨機(jī)采樣100只,清除殼上的污泥和寄生物后,用游標(biāo)卡尺測量殼長,記錄數(shù)據(jù)。

1.2 血細(xì)胞樣品的制備

從采集的扇貝中隨機(jī)抽取10只,現(xiàn)場取血。用滅菌的、內(nèi)含抗凝劑(0.02 mol/L EDTA,0.14 mol/L NaCl,3 mmol/L KCl,8 mmol/L Na2HPO4,1.5 mmol/L KH2PO4,p H=7.4)的注射器從扇貝閉殼肌血竇中按體積比1∶1抽血,每只扇貝抽取1 mL血淋巴;血淋巴與抗凝劑混合液于4℃、700 r/min、離心10 min;所得沉淀用1 m L抗凝劑重懸;重懸液經(jīng)超聲波細(xì)胞破碎儀破碎后,分裝,-80℃凍存。

1.3 抗櫛孔扇貝血細(xì)胞特異性單克隆抗體的篩選

從抗櫛孔扇貝血細(xì)胞的單克隆抗體(以下簡稱單抗;由中國海洋大學(xué)水產(chǎn)動物病害與免疫學(xué)研究室研制)庫中,通過間接免疫熒光法[17]和western blotting法[17]鑒定單抗與櫛孔扇貝血細(xì)胞的反應(yīng)特性,篩選出能與顆粒血細(xì)胞和透明血細(xì)胞特異性結(jié)合,并能與多個血細(xì)胞蛋白結(jié)合的抗櫛孔扇貝血細(xì)胞特異性單抗。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附法(EL ISA)檢測血細(xì)胞樣品

將1.2節(jié)中的凍存樣品在4℃下融化并包被于96孔酶標(biāo)板孔內(nèi),每孔100μL,4℃過夜;棄去孔內(nèi)液體,每孔加200μL含1.0%吐溫-20的PBS(簡稱:PBST)洗滌3次,5 min/次,洗完后每孔加200μL 3.0%牛血清白蛋白溶液,37℃封閉1 h;棄去孔內(nèi)液體,PBST洗滌3次后,每孔加100μL篩選出的一抗,37℃孵育1.5 h;棄去孔內(nèi)液體,PBST洗滌3次后,每孔加100μL堿性磷酸酶(簡稱:AP)標(biāo)記的羊抗小鼠二抗稀釋液,37℃孵育1 h;棄去孔內(nèi)液體,PBST洗滌3次后,每孔加100μL新配的、以mpNPP為底物的AP顯色液,室溫反應(yīng)20 min;每孔加50mmμL 2 mol/LNaOH終止顯色反應(yīng);于酶標(biāo)儀405 nm波長下讀數(shù),記錄數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每樣品重復(fù)檢測5次,用O rigin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)并作圖,用Duncan多重比較分析各值間的差異性(P<0.05表示差異顯著)。

2 結(jié)果

2.1 抗櫛孔扇貝血細(xì)胞特異性單抗的篩選

經(jīng)間接免疫熒光法和western blotting法從抗櫛孔扇貝血細(xì)胞的單抗庫中成功篩選到了1株符合以上2點要求的單抗1F7。該單抗陽性率高,并能與顆粒血細(xì)胞和透明血細(xì)胞特異性結(jié)合(見圖1);且能與血細(xì)胞蛋白成分中的多個蛋白(蛋白帶>8條)特異性結(jié)合(見圖2)。

2.2 殼長

青島地區(qū)的人工養(yǎng)殖扇貝,3月份時的殼長一般為(2.5±0.28)cm;3～8月這一時段增長迅速,其中8月的殼長已達(dá)(6.0±0.26)cm;8月之后,殼長雖繼續(xù)增加,但增加幅度明顯減緩,次年1月的殼長為(7.3±0.28)cm,較8月份僅增長1.3 cm左右(見圖3A)。野生扇貝的殼長雖在各時段均小于人工養(yǎng)殖扇貝,但增長趨勢與人工養(yǎng)殖扇貝基本相同,即3月的殼長為(2.4±0.25)cm,3～8月份增長迅速,其中8月份的殼長已達(dá)(5.5±0.22)cm;8月之后,殼長雖繼續(xù)增加但幅度明顯減緩,次年1月的殼長為(6.9±0.22)cm,較8月份僅增長1.4 cm左右(見圖3A)。

圖1 單抗1F7與櫛孔扇貝血細(xì)胞反應(yīng)的間接免疫熒光法檢測結(jié)果Fig.1 MAb 1F7 reacted with haemocytes of C.farreri detected by indirect immun of luoresence assay

圖2 單抗1F7與櫛孔扇貝血細(xì)胞反應(yīng)的western blotting檢測結(jié)果Fig.2 MAb 1F7 reacted with haemocytes of C.farreri tested by western blotting

威海地區(qū)的人工養(yǎng)殖扇貝3、4月的殼長分別為(2.4±0.24)和(2.6±0.31)cm;4～8月增長迅速,其中8月份的殼長已達(dá)(6.2±0.28)cm;8月之后,殼長雖繼續(xù)增加,但增加幅度明顯減緩,次年1月份的殼長為(7.3±0.24)cm,較8月僅增長1.1 cm左右(見圖3B)。野生扇貝的殼長雖在各時段均小于人工養(yǎng)殖扇貝,但增長趨勢與人工養(yǎng)殖扇貝基本相同,即3,4月的殼長分別為(2.2±0.24)和(2.5±0.31)cm;4～8月這一時段同樣增長迅速,其中8月的殼長已達(dá)(5.8±0.22)cm;8月份之后,殼長雖繼續(xù)增加但幅度明顯減緩,次年1月的殼長為(7.2±0.24)cm,較8月僅增長1.4 cm左右(見圖3B)。

圖3 青島(A)和威海(B)兩地區(qū)人工養(yǎng)殖的和野生的櫛孔扇貝殼長Fig.3 Shell height of artificial breeding and wild species of C.farreri in Qingdao(A)and Weihai(B)

圖4 青島(A)和威海(B)兩地區(qū)人工養(yǎng)殖的和野生的櫛孔扇貝血細(xì)胞數(shù)量的季節(jié)性變化Fig.4 Seasonal variation on haemocyte count of artificial breeding and wild species of C.farreri in Qingdao(A)and Weihai(B)detected by EL ISA

2.3 酶聯(lián)免疫吸附法(EL ISA)檢測血細(xì)胞樣品

青島地區(qū)人工養(yǎng)殖扇貝3、4月份的ELISA檢測OD405nm值分別為(0.575±0.019)和(0.588±0.021),從4月份開始顯著升高(P<0.05),于6月份達(dá)到峰值(0.685±0.019)。7、8、9月份急劇下降(P<0.05),其中9月僅為(0.418±0.019);從9月開始稍有回升,11月的值為(0.493±0.026),但仍顯著低于3～6月的各值(P<0.05);11月后又開始回落,次年1月的值僅為(0.443±0.012)(見圖4A)。野生扇貝OD405nm值一開始(3～6月)就維持在0.63之上的高水平,從6月開始急劇下降(P<0.05),其中9月份的值僅為(0.431±0.021),10～12月又有回升,12月的值為(0.516±0.023),但仍顯著低于年初水平(P<0.05);此后1月又有回落,其值為(0.427±0.012)(見圖4A)。

威海地區(qū)人工養(yǎng)殖扇貝OD405nm值一開始(3～7月)就維持在0.62之上的高水平,其中6月達(dá)到峰值(0.684±0.023),顯著高于其他4個月份(P<0.05);從7月開始急劇下降(P<0.05),于9月達(dá)到最低值(0.385±0.016);從9月開始有所回升,其中10～1月基本維持一個穩(wěn)定的水平,其值基本位于0.48左右,但仍顯著低于年初水平(P<0.05)(見圖4B)。野生扇貝3月的OD405nm值為(0.603±0.019);從3月開始顯著升高,于5月達(dá)到峰值(0.674±0.018);此后6,7,8,9月急劇下降(P<0.05),于9月達(dá)到最低值(0.431±0.019);此后的時段內(nèi)基本維持1個穩(wěn)定水平,其值基本位于0.46左右(見圖4B)。

3 討論

目前常見的用于檢測血細(xì)胞數(shù)量的方法有血球計數(shù)板法和流式細(xì)胞儀法。盡管這2種方法操作均較簡便,但血球計數(shù)板法主觀性強(qiáng),誤差大;流式細(xì)胞術(shù)則易將粘連細(xì)胞或雜質(zhì)碎片誤計為單個細(xì)胞。而基于抗原抗體反應(yīng)的EL ISA法經(jīng)過20多年的不斷完善,如抗原的包被,酶標(biāo)抗體的制備和純化,以及酶底物顯色系統(tǒng)的改進(jìn),具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可準(zhǔn)確定量出抗原含量等特點;更重要的是,EL ISA法可使取自不同時點的大批樣品達(dá)到同一時間檢測的效果[18-19]。

用基于單抗的EL ISA法來檢測全血細(xì)胞數(shù)量的精確與否,與第一抗體(即血細(xì)胞單抗)的特性密切相關(guān)。一方面既要保證該單抗與各種類型的血細(xì)胞均能特異性反應(yīng),且陽性率極高;另一方面又要保證該單抗的抗原決定簇極其豐富,即western blotting檢測結(jié)果為與血細(xì)胞成分的多個蛋白特異性結(jié)合,因為某一單抗雖具有抗各種類型血細(xì)胞的特性,但其抗原決定簇單一的話,在抗原包被中由于血細(xì)胞破碎液蛋白極其豐富,很有可能造成目標(biāo)蛋白未能完全吸附,進(jìn)而造成檢測的不準(zhǔn)確性。本文通過間接免疫熒光法和western blo tting法從抗櫛孔扇貝血細(xì)胞的單抗庫中成功篩選到了1株符合以上2點要求的單抗1F7,故將其作為本實驗EL ISA檢測中的第一抗體。此外本文還通過預(yù)實驗驗證了單抗1F7作為第一抗體的可行性:將血細(xì)胞破碎液作20,2-1,2-2,2-3,2-4,2-5,2-6,2-7,2-8梯度稀釋后包被,經(jīng)一抗,二抗,顯色液孵育后,發(fā)現(xiàn)20,2-1,2-2,2-3,2-4,2-5的OD405nm值存在顯著差異,2-6和2-7差異不是很大,而2-8基本接近于陰性對照,表明單抗1F7確實可用于定量血細(xì)胞的含量。

本文EL ISA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),4、5、6月扇貝的血細(xì)胞數(shù)量維持一個較高的水平,而這一時段恰逢水溫(12～18℃)適宜,餌料(浮游生物)豐富,扇貝性腺飽滿,生長快速,表明該時段扇貝處于1種生長旺盛的狀態(tài)。而接下來的7、8、9月,雖然餌料更為豐富,但其血細(xì)胞數(shù)量卻驟減,究其原因可能與高溫和繁殖耗能有關(guān)。櫛孔扇貝性腺成熟主要集中在5、6月,6月中旬開始產(chǎn)卵、排精直至8月中旬[20],之后性腺干癟,水溫明顯升高,扇貝處于1種生長緩慢的狀態(tài);加之病原[14]的侵染,導(dǎo)致了該時段扇貝血細(xì)胞數(shù)量的驟減。而血細(xì)胞數(shù)量的驟減則意味著扇貝免疫能力下降,是引起夏季大規(guī)模死亡的重要原因。Duchemin等[10]報道牡蠣(Crassostrea gigas)在繁殖期時的血細(xì)胞數(shù)量和吞噬力明顯低于繁殖前的各個時段;Lemaire等[21]也表明貽貝(My tilus spp.)在夏秋季時,其血細(xì)胞的數(shù)量和吞噬力低,死亡率高,主要因為貽貝恰處繁殖期,過多的耗能、過高的水溫以及病原增殖侵染所致。而Pipe和Coles[6],Carballal等[11],以及Matozzo等[22]則將繁殖期減少的那部分血細(xì)胞歸因于造血作用的耗竭亦或是血細(xì)胞從開放式循環(huán)系統(tǒng)遷移入各組織,尤其是性腺和外套膜等部位。9月份以后,隨著水溫的回落,以及扇貝的自身調(diào)節(jié),血細(xì)胞數(shù)量有所回升,但仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于春季水平,表明該時段扇貝仍處于恢復(fù)期;而年末的12、1月份血細(xì)胞數(shù)量仍未見明顯提升,主要受該時段水溫過低,餌料缺乏這些環(huán)境因子脅迫所致。

本研究認(rèn)為:櫛孔扇貝春季時由于水溫適宜,餌料豐富,其生長旺盛,血細(xì)胞數(shù)量高;而夏秋季因繁殖耗能,水溫過高和病原侵染等,生長緩慢,血細(xì)胞數(shù)量低。由此,適當(dāng)提前或推遲扇貝的繁殖期,避過夏秋季高溫和病原的刺激,可能會一定程度上減少扇貝的死亡。此外,青島和威海地區(qū)的人工養(yǎng)殖的和野生的櫛孔扇貝,其血細(xì)胞數(shù)量和生長變化趨勢基本相仿。

致謝:黃海水產(chǎn)研究所王崇明研究員在扇貝樣品采集和提供方面給予了的大力支持;李子牛、張冬冬同學(xué)在扇貝清洗和殼長測量方面給予了幫助;在此一并致以衷心的感謝!

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