鰻弧菌膜綁定溶胞壁質(zhì)轉(zhuǎn)糖酶MltD的表達(dá)純化及生物信息學(xué)分析*

徐子男,張曉華

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東青島266003)

鰻弧菌(Vibrio anguillarum)是1種革蘭氏陰性、嗜鹽的海洋魚類致病菌,它可引起魚類出血性敗血癥,即弧菌病,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。目前已知的鰻弧菌毒力相關(guān)因子主要有鐵吸收系統(tǒng)[4]、溶血素[5]、胞外金屬蛋白酶[6]以及外膜蛋白、脂多糖和細(xì)菌鞭毛等[7]。鰻弧菌的全基因組測序尚未完成,因而對其毒力相關(guān)因子的認(rèn)識還十分有限。為了發(fā)現(xiàn)新的毒力相關(guān)因子,以更好地研究鰻弧菌的致病機理,在前期研究中,作者利用抑制性消減雜交技術(shù)建立了鰻弧菌毒力相關(guān)基因文庫[8]。利用生物信息學(xué)方法對文庫中的基因進(jìn)行初步篩選,選取mltD基因及其編碼的膜綁定溶胞壁質(zhì)轉(zhuǎn)糖酶MltD作為本次的研究對象。

MltD蛋白是具有溶解肽聚糖功能的糖基轉(zhuǎn)移酶家族(Lytic Transglycosylase,L Ts)中的一員。該家族的酶類可以裂解肽聚糖中N-乙酰葡糖氨和N-乙酰胞壁酸之間的β-1,4糖苷鍵[9],被認(rèn)為在大腸桿菌的生長過程中至少2個階段發(fā)揮重要作用:擴(kuò)大胞壁質(zhì)和裂解隔膜促使子細(xì)胞分離[10]。然而,目前還沒有確鑿的實驗證據(jù)表明胞壁質(zhì)水解酶在細(xì)菌的生長過程中是必不可少的,去除1種甚至多種L Ts成員都不能導(dǎo)致細(xì)菌死亡,猜測L Ts成員之間存在相互替代作用[11-12]。也有報道認(rèn)為L Ts能使細(xì)菌外膜產(chǎn)生一定的孔隙讓新的肽聚糖進(jìn)入以維持細(xì)胞的生長[13]。此外L Ts還參與噬菌體的進(jìn)出和Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型分泌系統(tǒng)的活動,使胞內(nèi)的一些復(fù)合物(如DNA、毒素和鞭毛等)通過其形成的孔隙轉(zhuǎn)運出去[14],推測L Ts家族在致病菌胞外產(chǎn)物尤其是毒素的分泌中可能發(fā)揮一定的作用。目前,對MltD蛋白的研究還非常少。首次報道是在大腸桿菌中,研究表明MltD蛋白可水解肽聚糖,并引起細(xì)菌細(xì)胞裂解[15]。在幽門螺桿菌中,通過基因敲除的方法構(gòu)建了mltD基因突變株;與野生株進(jìn)行性質(zhì)比較,發(fā)現(xiàn)MltD蛋白具有轉(zhuǎn)移糖鏈內(nèi)部糖基的作用,并由此導(dǎo)致肽聚糖裂解[16]。

本研究將鰻弧菌MltD蛋白在大腸桿菌中過量表達(dá)和純化,并利用生物信息學(xué)方法對其進(jìn)行了分析,以進(jìn)一步探討該蛋白在鰻弧菌致病過程中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

鰻弧菌CW-1由本實驗室分離;大腸桿菌JM 109、BL21(DE3)和表達(dá)載體p ET-32a(+)為本實驗室保存;載體simp le pMD-19T購自大連寶生物工程公司。

1.2 主要工具酶及其他試劑

Taq DNA聚合酶、dN TP、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、DNA Marker、蛋白Marker(大連寶生物工程公司);Ni-N TA樹脂(Novagen);其他試劑購于上海生工生物工程有限公司。

1.3 鰻弧菌CW-1的mltD基因表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)鰻弧菌CW-1的mltD基因全長(GenBank登錄號:GU 187046)設(shè)計一對引物。上游引物起始于起始密碼子,下游引物終止于終止密碼子前(不包括終止密碼子),并分別在引物的5’端加入了Eco R I和Xho I的酶切位點。引物序列如下:m d-L:5′-GAA TTC ATG CGA TTTCAA TTTAGCT-3′;m d-R:5′-CTCGAGTACACTGACCTTAGTGACA T-3′。加粗部分為起始密碼子,下劃線示酶切位點。以鰻弧菌CW-1的基因組DNA為模板,PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 m in;94℃1 m in,54℃1 m in,72℃1.5 m in,30個循環(huán);72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后連接載體simp le pMD-19T,轉(zhuǎn)化JM 109,挑取陽性克隆,送上海生工生物工程公司測序。從測序結(jié)果正確的克隆中提取重組質(zhì)粒,限制性內(nèi)切酶Eco R I和Xho I分別雙酶切重組載體simp le pMD-19T/mltD和表達(dá)載體p ET-32a(+)。并各自回收目的片斷,經(jīng)T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM 109,在含100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 h,隨機挑取菌落,經(jīng)8 h增菌后提取質(zhì)粒DNA,用Eco R I和Xho I雙酶切法和PCR法鑒定陽性克隆。將陽性克隆中的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)構(gòu)建表達(dá)菌株,命名為BL21(DE3)/p ET-32a(+)/mltD[17]。

1.4 鰻弧菌CW-1的MltD融合蛋白在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將重組菌BL 21(DE3)/p ET-32a(+)/mltD接種于5 m L含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日取500μL菌液接入5 mL相同的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h(OD600約0.6)后,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG,37℃振蕩培養(yǎng)6 h,取菌液1 m L,5 000 r/m in離心10 m in,分別收集菌體和上清液。12%SDS-PAGE鑒定MltD融合蛋白的表達(dá)[18]。攜帶有空質(zhì)粒的大腸桿菌BL 21/p ET-32a(+)和不攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌BL 21作為陰性對照。將經(jīng)SDSPAGE鑒定有MltD融合蛋白表達(dá)的菌落,接種于500 mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,按上述條件進(jìn)行大量誘導(dǎo)。8 000 r/min、4℃離心15 min,細(xì)菌沉淀重懸于10 m L細(xì)菌裂解緩沖液中(8 mol/L尿素,0.5 mo l/L NaCl,20 mmol/L PBS,p H=7.4,1 mg/m L溶菌酶),低溫條件下超聲波破碎,8 000 r/min、4℃離心30 min,取上清過Ni-N TA層析柱。分別用20 m L(8 mol/L尿素,0.5 mol/L NaCl,20 mmol/L PBS,p H=6.3)、10 mL(8 mol/L尿素,0.5 mol/L NaCl,20 mmol/L PBS,p H=5.9)洗滌緩沖液沖洗層析柱,最后用10 mL洗脫緩沖液(8 mol/L尿素,0.5 mol/L NaCl,20 mmol/L PBS,p H=4.5)洗脫目的蛋白,12%SDS-PAGE電泳鑒定。

1.5 鰻弧菌CW-1 MltD蛋白的生物信息學(xué)分析

通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析基因的功能區(qū)。采用在線軟件對由mltD核苷酸序列推測的氨基酸序列進(jìn)行物理性質(zhì)(http://cn.expasy.org/tools/protparam.html)、二級結(jié)構(gòu)(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)、跨膜區(qū)及信號肽(http://phobius.sbc.su.se/)和(http://www.cbs.dtu.dk/services/Lipo P/)、疏水性(http://www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl)和抗原決定簇等信息的預(yù)測分析。

采用Clustal X進(jìn)行多序列比對,應(yīng)用M EGA 3.1建立了MltD蛋白在弧菌屬及相關(guān)細(xì)菌種類間的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

為了在大腸桿菌中過量表達(dá)鰻弧菌MltD蛋白,將鰻弧菌CW-1的mltD基因克隆到表達(dá)載體p ET-32a(+)的EcoR I和Xho I酶切位點之間,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒p ET-32a(+)/mltD,其雙酶切結(jié)果表明基因mltD已成功連接到表達(dá)質(zhì)粒p ET-32a(+)中(見圖1)。陽性重組質(zhì)粒由上海博尚公司測序,測序結(jié)果與mltD(GenBank登錄號:GU187046)核苷酸序列進(jìn)行ClustalW比對(http:∥www.ebi.ac.uk/clustalw/),證實兩者的序列完全一致。

圖1 p ET-32a(+)/mltD表達(dá)質(zhì)粒的Eco R I和Xho I雙酶切圖譜Fig.1 Restriction patterns of the recombinant plasmid pET-32a(+)/mltDdigested with Eco RIand XhoI

2.2 鰻弧菌CW-1的mltD基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

鑒定為陽性克隆的大腸桿菌BL 21/p ET-32a(+)/mltD經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后,菌體裂解液在SDS-PAGE電泳圖譜中66.2 kDa稍偏上處有1條特異性誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白條帶(見圖2),而在培養(yǎng)上清液中未檢測到特異性表達(dá)的蛋白。在大腸桿菌BL 21/p ET-32a(+)和BL 21的菌體中未檢測到特異性誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白條帶。

圖2 誘導(dǎo)重組菌BL21/p ET-32a(+)/mltD表達(dá)后菌體裂解液的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressed protein of the recombinant E.coli BL 21/p ET-32a(+)/mltD

圖3 親和層析純化MltD蛋白的SDS-PAGE電泳Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purified MltD

2.3 鰻弧菌MltD蛋白的純化

將菌株BL21/p ET-32a(+)/mltD大量培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá),破碎裂解后經(jīng)Ni親和層析柱分離純化。SDSPA GE電泳分析顯示,純化的鰻弧菌MltD融合蛋白為單一條帶,分子量約為70.2 kDa,與理論推測一致(見圖3)。該融合蛋白前端帶有表達(dá)載體p ET-32a(+)上的硫氧還原蛋白TRX標(biāo)簽,分子量約為11.8 kDa;后端帶有6-his標(biāo)簽以便純化。

2.4 鰻弧菌MltD蛋白的生物信息學(xué)分析

2.4.1 物理性質(zhì)分析 預(yù)測結(jié)果表明,鰻弧菌的MltD蛋白的分子量為58.38 kDa;理論等電點為9.42;不穩(wěn)定系數(shù)為27.40,是1個物理性質(zhì)穩(wěn)定的蛋白質(zhì);疏水性分析的GRAV Y值是-0.401,為親水性蛋白。

2.4.2 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 鰻弧菌MltD蛋白的二級結(jié)構(gòu)中含有37.86%(198/523)的α螺旋、11.66%(61/523)的平行和/或反平行β折疊、7.84%(41/523)的β轉(zhuǎn)角和42.64%(223/523)的無規(guī)則卷曲。

2.4.3 跨膜區(qū)域及信號肽預(yù)測 鰻弧菌MltD蛋白只有1個跨膜區(qū),與信號肽區(qū)域重合,為N端前21個氨基酸,且其N端前15個氨基酸為1個脂蛋白信號肽。預(yù)測還顯示,除信號肽區(qū)域外,此蛋白的其余部分為非細(xì)胞質(zhì)蛋白(見圖4)。由此,推測鰻弧菌MltD蛋白為分泌型脂蛋白;它不是膜內(nèi)蛋白,很可能是外周膜蛋白,且與細(xì)胞膜間僅有非常松散的結(jié)合。

圖4 鰻弧菌菌株CW-1的MltD蛋白信號肽分析Fig.4 Signal pep tide analysis of protein MltD in V.anguillarum strain CW-1

2.4.4 結(jié)構(gòu)分析 鰻弧菌的MltD蛋白由523個氨基酸組成,其功能區(qū)結(jié)構(gòu)與大腸桿菌的MltD蛋白大體相似,都在N端具有信號肽和1個糖基轉(zhuǎn)移酶(Transglycosylase)結(jié)構(gòu)域SL T,不同之處在于:鰻弧菌MltD蛋白的C端有3個溶解酶結(jié)構(gòu)域LysM,而大腸桿菌的MltD蛋白則含有2個LysM(見圖5)。

2.4.5 抗原決定簇預(yù)測 利用Kolaskar-Tongaonakar法預(yù)測了鰻弧菌MltD蛋白的抗原表位,該方法基于對已經(jīng)實驗測定的已知蛋白表位中各氨基酸殘基出現(xiàn)的頻率計算,并采用抗原傾向性(Antigenic propensity)作為預(yù)測參數(shù)。預(yù)測結(jié)果表明,該MltD蛋白的平均抗原傾向性指數(shù)為1.024 6,說明整個分子具有較強的抗原性;分子內(nèi)抗原表位較豐富,共有24個可能的抗原決定簇(見圖6)。

2.4.6 系統(tǒng)進(jìn)化分析 經(jīng)序列比對,鰻弧菌MltD蛋白與創(chuàng)傷弧菌、弗氏弧菌、溶珊瑚弧菌、東方弧菌、梅氏弧菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、燦爛弧菌、擬態(tài)弧菌、霍亂弧菌、費氏弧菌、深海發(fā)光桿菌、大西洋假交替單胞菌和大腸桿菌的MltD蛋白的相似性分別為77%,77%,76%,76%,74%,73%,72%,71%,71%,68%,68%,62%,55%,53%和34%。可見MltD蛋白在弧菌中保守性較高,在一定程度上可以反應(yīng)細(xì)菌的親緣關(guān)系(見圖7)。

圖7 鰻弧菌CW-1及其相關(guān)菌株MltD蛋白構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic relationships by neighbor-joining(NJ)method based on protein MltD sequences showing the positions of V.anguillarum strain CW1 and its relatives

3 討論

對MltD蛋白的研究目前只在大腸桿菌和幽門螺桿菌中有報道,除了已知它可以水解肽聚糖并導(dǎo)致細(xì)胞裂解外,其他具體功能尚不清楚。為研究鰻弧菌MltD蛋白的功能,本研究構(gòu)建了MltD蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng),成功誘導(dǎo)并純化了MltD融合蛋白。

Dijkstra等[15]應(yīng)用表達(dá)載體p ET-21(d)構(gòu)建了大腸桿菌MltD蛋白的表達(dá)載體,并在大腸桿菌中過量誘導(dǎo)表達(dá)該MltD蛋白。他們發(fā)現(xiàn),在普通的LB液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)該蛋白時,被誘導(dǎo)的細(xì)胞會在15 min內(nèi)發(fā)生大范圍的裂解;而在LB培養(yǎng)基中加入12%的蔗糖和10 mmol/L的MgSO4平衡滲透壓的條件下進(jìn)行誘導(dǎo),細(xì)菌細(xì)胞則沒有發(fā)生裂解,光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),細(xì)胞變?yōu)闊o細(xì)胞壁的原生質(zhì)球。然而在本研究的誘導(dǎo)表達(dá)過程中,未見此現(xiàn)象的發(fā)生。分析可能原因,一是由于所選擇的表達(dá)載體不同而導(dǎo)致所形成的融合蛋白可能存在差異,從而影響了MltD蛋白本身的功能;二是MltD蛋白的功能可能具有種屬特異性,本實驗中所表達(dá)的鰻弧菌MltD蛋白對表達(dá)菌株大腸桿菌BL 21的細(xì)胞肽聚糖沒有裂解作用。

本研究還對鰻弧菌MltD蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。分析結(jié)果表明,鰻弧菌的MltD蛋白由523個氨基酸構(gòu)成,在C端含有3個溶解酶LysM結(jié)構(gòu)域;而大腸桿菌的MltD蛋白由452個氨基酸構(gòu)成,只有2個LysM結(jié)構(gòu)域[19]。有報道稱,LysM結(jié)構(gòu)域在細(xì)菌乃至真核生物的蛋白質(zhì)中廣泛分布,推測其具有與肽聚糖綁定的功能,另外也有報道認(rèn)為它與一些細(xì)菌的致病性相關(guān)[19]。鰻弧菌MltD蛋白的N端有一段脂蛋白的信號肽,與大腸桿菌的MltD蛋白一致,可能為一種脂蛋白。有研究稱細(xì)菌的脂蛋白在細(xì)菌致病性方面起著重要作用[20],這進(jìn)一步增加了鰻弧菌MltD蛋白與鰻弧菌致病性相關(guān)聯(lián)的可能性。生物信息學(xué)的分析結(jié)果與我們前期研究中由抑制性消減雜交文庫得到的推論相一致[8]。

生物信息學(xué)的分析還顯示,鰻弧菌MltD蛋白除信號肽外沒有跨膜區(qū),且為非細(xì)胞質(zhì)蛋白,推測其可能為外周膜蛋白,與細(xì)胞膜只有比較松散的連接。該蛋白分子的抗原性強,存在24個抗原表位,且序列組成在弧菌中相對保守,可以應(yīng)用于抗弧菌病疫苗的研究開發(fā)。

本研究為今后進(jìn)一步探究鰻弧菌MltD蛋白的功能及其在細(xì)菌致病過程中發(fā)揮的作用打下了基礎(chǔ)。

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