單環刺螠纖溶酶Ⅱ的基因克隆*

韓寶芹,馮伊琳,畢慶慶,劉萬順,隋正紅,楊官品

(中國海洋大學海洋生命學院,山東青島266003)

血栓性疾病(腦血栓、冠心病、血栓栓塞性脈管炎、心肌梗塞等)一直嚴重威脅著人類的健康,這類疾病發病率高,死亡率高,致殘率高,且疾病發生率隨人口老齡化程度的加深而提高。據相關資料顯示,全世界每年有1750萬人死于心腦血管病,我國心腦血管疾病患者已經超過2.7億人,每年死于心腦血管疾病的患者多達300萬,已成為心腦血管病發病和死亡最嚴重的國家[1]。

栓塞性疾病主要有3種治療手段:外科手術,長期服用抗凝劑,藥物溶栓。其中,溶栓藥物治療的方法最為重要也最具發展潛力。目前臨床應用的溶栓藥物雖然已經發展到第三代,但很多藥物的療效并不理想,存在著特異性差,副作用重,半衰期短等缺點,又或是生產不易,物稀價昂[2-5],因此,對于溶栓特異性好,半衰期長,生產制備容易的溶栓劑的開發需求迫切。

本實驗室經多年研究,從海洋無脊椎動物單環刺螠(Urechis unicinctus)中分離出了1種新型纖溶酶,命名為單環刺螠纖溶酶(UFE)。該酶包括4個分子量組分,按照分子量由大到小,分別是單環刺螠纖溶酶Ⅰ,單環刺螠纖溶酶Ⅱ,單環刺螠纖溶酶Ⅲ和單環刺螠纖溶酶Ⅳ。4個單環刺螠纖溶酶組分均具有提高受試機體繼發性纖溶活性的能力,具有顯著的抗凝活性和纖溶活性以及較好的生物安全性,故具有較大的開發價值[6-7]。但是從生物體中直接提取,以分離純化的方法進行生產存在許多弊端,如生產工藝復雜,生產質量不穩定,產率低等。為解決上述問題,本研究克隆了該纖溶酶Ⅱ的全長cDNA序列,并通過生物信息學分析,初步確定其編碼的蛋白質是1種胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶,為進一步開展基因工程菌的構建,重組活性蛋白的表達奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

單環刺螠購于青島海產品市場。經分離純化得到的單環刺螠纖溶酶Ⅱ(分子量26 kDa)純品,本實驗室制備。E.coli DH5α和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司;質粒pMD18-T,Ex Taq DNA聚合酶,PrimeScrip t 1st Strand cDNA Synthesis Kit,5′-Full RACE Kit等均購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質測序 單環刺螠纖溶酶Ⅱ蛋白質由北京華大蛋白質研究中心測序,得到N-末端序列:ICGGSPAD IT。

1.2.2 單環刺螠總RNA提取 用酸性酚-異硫氰酸胍法提取整個蟲體總RNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量[8],并于-80℃保存備用。

1.2.3 cDNA第一鏈合成 根據Prime Scrip t 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書進行并用設計合成的3’RACE Adaptor:5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGA TTTCACTA TAGGTTTTTT TTTTTTTTTT-3’替代試劑盒中自帶的Oligo d T Primer做反轉錄引物,得到cDNA第一鏈。

1.2.4 簡并PCR 根據已測定的單環刺螠纖溶酶ⅡN-端序列ICGGSPAD IT,設計簡并正向引物103:5’-TCNCCNGCNGA YA THAC-3’,104:5’-AGYCCNGCNGA YA THAC-3’,根據3’RACE Adap tor設計反向引物OP:5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGA TTT-3’。擴增體系:cDNA模板0.5μL,10×buffer 2.5μL,25mmol/L MgCl23μL,2.5 mmol/LdN TP 2μL,10μmol/L正向引物103/104 2.5μL,10μmol/L反向引物OP 1μL,ddH2O 13.3μL,r Taq DNA聚合0.2μL,總體積25μL。反應條件為:94℃預變性2 min;94℃變性30 s,60℃退火1 min,72℃延伸1 min,30個循環;72℃延伸10 min。擴增得到的PCR產物經瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收,回收產物與pMD18-T載體16℃過夜連接得連接載體。將連接載體用42℃熱激法轉化感受態E.coli DH5α,涂布含氨芐青霉素的LB固體培養基,37℃培養。挑取培養基上的單克隆分別接種入含氨芐青霉素的液體LB培養基中,37℃培養擴增,用特異性引物103/104與OP進行菌落PCR驗證陽性克隆,陽性菌株測序。

1.2.5 5’RACE PCR 根據5′-Full RACE Kit說明書進行5’-RACE PCR。所用特異性引物根據上述簡并PCR產物測序結果設計,GSP1:5’-TTTACATGCGTTCGGCAATCCA-3’,GSP2:5’-ATTGTTGTAGTCGCTGTGCTCGTC-3’,擴增體系及參數見說明書,其中PCR退火溫度為55℃。其他程序同1.2.4。

1.2.6 單環刺螠纖溶酶Ⅱ基因(ufeⅡ)全長擴增根據5’RACE PCR測序結果設計正向引物stt:5’-GCGACTCCTGCA TTA TGAAGACTC-3’,根據簡并引物PCR測序結果設計反向引物OP:5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGA TTT-3’。擴增體系:cDNA模板1μL,TaKaRa Ex Taq 0.25μL,10×Ex Taq Buffer 5μL,2.5mmol/L dN TP4μL,10μmol/L正向引物stt 2μL,10μmol/L反向引物OP 2μL,ddH2O 35.75μL,總體積50μL。擴增條件中退火溫度為55℃,其余程序同1.2.4。

1.2.7 生物信息學分析 cDNA序列使用NCB I BLASTx程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行比對分析,使用Bio Edit軟件將cDNA序列翻譯為氨基酸序列,對推導出的蛋白序列使用NCB I(http:∥www.ncbi,nlm,nih.gov/Structure)保守區域數據庫CDD(Conserved Domain Database)以及PROSITE的ScanProsite軟件(http://expasy.org/tools/scanp rosite/)進行蛋白質結構域及活性位點預測,SingalP程序分析信號肽。不同來源的絲氨酸蛋白酶家族成員用ClustalW創建1個多序列的比對結果,系統發生和進化的分析在比對的基礎上用MEGA 4.0軟件完成,系統樹采用Neighbor_joining方法構建,bootstrap值為1 000。

2 結果與討論

2.1 單環刺螠總RNA提取

新鮮蟲體提取總RNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測,如圖1所示,可見清晰的28s、18s、5s條帶,無拖尾,總RNA質量良好,可用于逆轉錄反應。

圖1 單環刺螠蟲體總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose electrophoresis of total RNA from Urechis unicinctus

2.2 單環刺螠纖溶酶Ⅱ基因(ufeⅡ)全長cDNA擴增

2.2.1 簡并PCR 以總RNA為模板,3’RACE A dap tor為反向引物,反轉錄第一鏈cDNA。以此為模板,用引物103和OP擴增出大小約800 bp的產物(見圖2)。

圖2 簡并PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose electrophoresis of degenerated PCR

2.2.2 5’RACE PCR 根據簡并PCR產物的測序結果設計引物,使用5′-Full RACE Kit(TaKaRa)擴增得到大小約400 bp的產物(見圖3),測序結果與簡并引物PCR擴增產物測序結果有228個堿基的重疊。

2.2.3 單環刺螠纖溶酶Ⅱ基因(ufeⅡ)全長cDNA擴增 根據2次測序結果分別設計正反向引物擴增ufeⅡ全長,得到大小約800 bp的PCR產物(見圖4)。

將擴增產物進行測序,該測序結果結合3’,5’RACE PCR測序結果的末端,得到單環刺螠纖溶酶Ⅱ基因全長cDNA序列(見圖5)。全長cDNA為906bp(GenBank accession number HM 623463),其中開放閱讀框795 bp。

圖3 5’RACE擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose electrophoresis of 5’RACE PCR

圖4 全長cDNA擴增瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose electrophoresis of full length cDNA amplification

圖5 單環刺螠纖溶酶Ⅱ基因及其編碼氨基酸序列方框中依次為:起始密碼子,蛋白質N端序列,終止密碼子Fig.5 Nucleo tide sequence and deduced amino acid sequence of the UFE cDNA.Boxes:start codon,protein Nterminal sequence,stopcodon

2.3 單環刺螠纖溶酶Ⅱ基因的生物信息學分析

2.3.1 單環刺螠纖溶酶Ⅱ基因同源序列分析BLASTx比對結果見圖6。如圖6所示,與本研究得到的序列的編碼產物相似度較高的蛋白質為沙躅胰凝乳蛋白酶原,蚓激酶,蚯蚓纖溶酶,孢囊線蟲和櫛孔扇貝的絲氨酸蛋白酶等,因單環刺螠作為1種海洋生物,其基因組具有一定特殊性,故使用核苷酸序列比對時未見相似度高的序列。

圖6 單環刺螠纖溶酶Ⅱ與其他蛋白質相似性比對Fig.6 Similarity comparison of amino acid sequence between amplified product and other proteins in database

圖7 利用NJ法繪制的14種絲氨酸蛋白酶家族成員的進化樹Fig.7 Neighbor-joining phylogenic tree of 14 different Protease amino acid sequences from serine p rotease family

本文比對了14個不同的絲氨酸蛋白酶家族成員并計算了它們的氨基酸相似性,利用M EGA軟件對這些序列進行了分子系統學分析,在構建了系統發生樹的基礎上研究了單環刺螠纖溶酶Ⅱ和其他絲氨酸蛋白酶家族成員之間的進化關系(見圖7)。結果顯示,不同物種來源的絲氨酸蛋白酶在一定程度上是相關的。從系統進化樹上可以看到,單環刺螠纖溶酶Ⅱ在進化上與來源于沙躅的胰凝乳蛋白酶原,以及蚓激酶等來源于蚯蚓的蛋白酶親緣關系較近。

2.3.2 單環刺螠纖溶酶Ⅱ基因氨基酸序列保守性在NCB I(http:∥www.ncbi,nlm.nih.gov/Structure)保守區域數據庫CDD(Conserved Domain Database)中分析單環刺螠纖溶酶Ⅱ氨基酸序列的保守性(見圖8)。結果顯示該酶屬于胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶家族,通常為無活性前體酶原形式,經過限制性蛋白酶水解產生有活性的酶,剪切位置在第31-32氨基酸處,預測的剪切位置與蛋白質N端序列位置吻合。單環刺螠纖溶酶包含3個絲氨酸蛋白酶活性位點(催化三聯體),并具有3個特異性底物結合位點。

圖8 單環刺螠纖溶酶Ⅱ保守區分析Fig.8 Conserved domain analysis of UFEⅡ

使用PROSITE的Scan Prosite軟件對氨基酸序列進行分析[9],該蛋白質含有1個tryp sin domain第32-264位,起始位點與蛋白質N端位置一致,其中第72位組氨酸(H)、第119位天冬氨酸(D)、第214位絲氨酸(S)為活性位點[10-11]。

2.3.3 單環刺螠纖溶酶Ⅱ基因(ufeⅡ)氨基酸序列信號肽預測 根據http://cbs.dtu.dk/services/SignalP/中信號肽分析軟件對單環刺螠纖溶酶Ⅱ氨基酸序列的分析,目標蛋白在第15和16個氨基酸之間被信號肽酶酶切的可能性最大,因此單環刺螠纖溶酶Ⅱ的信號肽應該是包含1～15個氨基酸殘基的N端肽鏈。

2.3.4 單環刺螠纖溶酶Ⅱ分子量預測 單環刺螠纖溶酶Ⅱ前體肽氨基酸序列是根據基因序列推導出的,共有264個氨基酸,相對分子量為27030.59 Daltons(EditSeq),是分泌到胞外有活性的單環刺螠纖溶酶Ⅱ的未經過剪切加工的前體肽,根據NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure)保守區域數據庫CDD(Conserved Domain Database)中分析,剪切后的活性蛋白質由32～264位氨基酸組成,即除了切除信號肽外還經過其它加工,需要再切除16個氨基酸長的肽段,分子量為23905.85 Daltons(EditSeq)。

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