精制狗皮膏揮發性成分的提取及其GC-MS分析

顏巧蓉 唐宇航 劉文涵

（浙江工業大學化學工程與材料學院，浙江 杭州 310014）

中成藥精制狗皮膏具有舒筋、活血、散寒、止痛的功效，用于治療筋骨痛、急性挫傷、扭傷、風濕痛、關節痛、脅痛、肌肉酸痛等癥。主要由生川烏、防己、山柰、透骨草、延胡索、干姜、辣椒、樟腦、冰片等十二味中藥制備而成［1］。其中山柰、透骨草、干姜、樟腦、冰片等含有揮發性成分，這些揮發性成分具有一定的藥理和藥效，是質量評價的重要指標［2］。

目前，精制狗皮膏的質量控制中只有粉防己堿、延胡索的薄層色譜鑒別和含膏量檢查［1］，僅就這兩項指標控制該產品的質量未免有失全面。本文采用氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用技術對精制狗皮膏進行了揮發性成分分析，為有效控制產品的質量提供理論依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

精制狗皮膏（國內某品牌，批號：100501，購于杭州藥店）。

GC6890N/MSD5973N氣相色譜-質譜聯用儀（美國Agilent公司）；TC-15型恒溫電熱套（海寧市華星儀器廠）；AL204型電子天平（Mettler-Toledo Group）；揮發油提取器（油比水輕型）。

乙酸乙酯、丙酮、乙醚、二氯甲烷、正己烷、無水硫酸鈉均為分析純；水為超純水（電阻率≥18.3MΩ·cm，自制）。

1.2 供試品溶液的制備

取樣品2貼，除去蓋襯，剪成小碎片，置500mL圓底燒瓶中，加入200mL超純水和數粒玻璃珠，室溫浸泡0.5h，接妥揮發油提取器，由其上端加入超純水至溢流入圓底燒瓶為止，加入1mL乙酸乙酯。置電熱套中緩緩加熱至沸開始計時，并保持微沸4h。停止加熱，靜置冷卻，取乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥后置于容量瓶中，并用適量溶劑洗滌揮發油測定器數次，洗滌液并入容量瓶中，用溶劑定容，搖勻。過0.45μm膜，供GC-MS分析。

1.3 GC-MS分析條件

色譜條件：HP-5MS色譜柱（30m×0.25mm，0.25μm）；載氣：高純氦（99.999％），流速：0.8mL·min-1（恒流）；進樣口溫度：250℃；程序升溫：初溫50℃，保持5min，然后以5℃·min-1升至260℃，保持10min；進樣量：1μL；分流比：20：1。

質譜條件：離子源：EI源；電子轟擊能量：70e V；倍增電壓：1 294V；離子源溫度：230℃；接口溫度：280℃；質量掃描范圍：45amu～500amu；溶劑延遲：4.5min。

2 結果與討論

2.1 前處理方法研究

2.1.1 浸泡時間的考察

不同的浸泡時間對中藥提取度的影響不同。本次實驗分別考察了浸泡0.5h和3h的效果，結果發現浸泡時間對揮發油提取率及成分基本無影響。考慮到實驗操作過程中的實際性，選擇浸泡時間為0.5h。

2.1.2 萃取溶劑的選擇

在前處理中，選用不同的溶劑作為萃取蒸餾液溶劑時得到的結果差別比較大。本實驗分別考察了丙酮、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、正己烷這5種溶劑，發現用乙醚和正己烷作為萃取溶劑時得到的TIC峰的數目較其它三種萃取溶劑多。而用乙醚和正己烷這兩種溶劑萃取出的組分色譜圖在色譜峰的個數和含量上差別不大；考慮到乙醚的揮發性較正己烷強，在提取過程中以及提取物的保存中都不如正己烷溶劑穩定，所以本文選擇正己烷作為萃取溶劑。

2.1.3 單次加水量的確定

為考察單次加水量對揮發油得率的影響情況，固定其它條件不變，改變單次加水量。隨著加水量的增加，峰響應值先增加后減少，單次加水量為200mL時響應值最高。因此，在后面的提取實驗中選擇加200mL超純水。

2.1.4 提取時間的優化

實驗過程中，提取時間是比較關鍵的影響因素之一，本文考察了提取時間分別為1h、2h、3h、4h、5h和6h的試驗情況。結果表明：在0～4h內響應值隨著提取時間的延長而增加，4h后響應值略有上升但幅度不大，為了節約時間，提高工作效率，選擇4h為最佳提取時間。

2.1.5 重現性實驗

為進一步驗證實驗結果的可靠性與重復性，在以上確定的條件下做3次實驗，3次實驗TIC峰的數目相同且強度也相差很小，說明在此條件下實驗重現性較好。

2.2 精制狗皮膏揮發性成分分析

在優化的實驗條件下，提取精制狗皮膏中的揮發性成分并進行GC-MS分析，所得總離子流圖（TIC）見圖1。

圖1 精制狗皮膏揮發性成分總離子流圖Fig 1 Total ion chromatography of volatile components from Refining Cream dogskin

通過檢索NIST 2005譜圖庫，并查閱有關文獻［3-10］與標準譜圖庫對照分析，確認精制狗皮膏揮發性組分的化學成分。共檢出76個色譜峰，鑒定了其中59個化合物，占總峰面積的92.70％。采用峰面積歸一化法求得各組分在揮發油中的相對百分含量，結果見表1。

表1 精制狗皮膏揮發性化學成分Tab 1 Chemical components of volatile compounds from Refining Cream dogskin

續表1

由表1可知，精制狗皮膏的主要成分為樟腦（36.35％）、薄荷腦（21.43％）和水楊酸甲酯（15.95％），其中相對百分含量超過1％的還有長葉烯（7.94％）、右松酯醛（2.71％）、石竹烯（1.77％）和西柏烯（1.24％），上述成分占揮發油總量的87.39％。從化合物種類來看，主要為萜烯類及其含氧衍生物（41種，75.66％）、芳香族類（5種，16.68％）和烷烴類（12種，0.36％）化合物。萜類化合物中含單萜類12種，倍半萜類23種，二萜類6種，這些萜類化合物具有抗炎、止痛、消腫等多種功效，這與精制狗皮膏的藥效基本一致。

3 結論

本文通過單因素試驗對精制狗皮膏揮發性成分提取過程中的多種因素進行了優化，確定最佳提取條件為：室溫下超純水浸泡0.5h，單次加水量200mL，水蒸氣蒸餾提取4h，萃取溶劑選用正己烷。采用GC-MS法對提取的揮發性成分進行了分離和鑒定，共分離出76個組分，并鑒定了其中59個化合物，主要為單萜烯類、倍半萜烯類及其含氧衍生物。此研究結果可為精制狗皮膏氣相色譜指紋圖譜的研究及其質量控制提供依據。

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［3］Wang Z M，Wang L，Li T C，et al.Rapid analysis of the essential oils from dried Illicium verum Hook.f.and Zingiber officinale Rosc.by improved solvent-free microwave extraction with three types of microwave-absorption medium［J］.Anal Bioanal Chem，2006，386（6）：1867.

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［5］容 蓉，邱麗麗，劉 朋，等.干姜揮發性成分的水蒸氣蒸餾提取與頂空進樣氣相色譜-質譜分析［J］.時珍國醫國藥，2010，21（11）：2811.

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［7］崔炳權，郭曉玲，林元藻.海南產山柰揮發油化學成分分析［J］.中國藥房，2008，19（3）：216.

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