紅茶菌中優勢微生物的分離鑒定及系統發育分析

喬宏萍, 沙大年, 金泰廙, 杭曉敏

(1.上海交大昂立股份有限公司生物醫藥研究所,上海 200233;2.復旦大學公共衛生學院,上海,200032)

紅茶菌中優勢微生物的分離鑒定及系統發育分析

喬宏萍1,2, 沙大年＊1, 金泰廙2, 杭曉敏1

(1.上海交大昂立股份有限公司生物醫藥研究所,上海 200233;2.復旦大學公共衛生學院,上海,200032)

采用不同的培養基對紅茶菌優勢微生物進行了分離,共得到酵母菌8.3×106個/mL,醋酸菌1.4×107個/m L,選取不同的菌落進行純化后得到2株醋酸菌和4株酵母菌。經過分子生物學鑒定和系統發育樹分析后,初步確定AC1為醋酸桿菌Acetobacter senegalensis,AC2為葡糖醋桿菌Gluconacetobacter saccharivorans;Y1為膜璞畢赤酵母Pichia membranifaciens,Y2為畢赤酵母Pichia galeiform is,Y3為異型德克酵母Dekkera anomala,Y4為拜耳接合酵母Zygosaccharom yces bailii。

紅茶菌;醋酸菌;酵母菌;系統發育樹

紅茶菌是一種在國內外具有悠久歷史的功能 性飲料,它是由醋酸菌、酵母菌等有益微生物共同自然發酵而成。其保健功能主要表現在清理腸胃,幫助消化,抑制有害菌,防治胃腸道疾病,預防結腸癌的發生,防治高血壓和動脈硬化以及增強機體免疫力等。目前,對紅茶菌的培養依然是以傳統的家庭培養為主,實現工業化生產依然存在很多問題。首先,混合菌種的接種條件、接種量以及優勢菌群等還沒有系統全面的研究報道;其次,每一個菌種的代謝特征、培養條件和功能效果等方面還沒有深入細致的研究;另外,抑菌和保健功能的作用機理還沒有完全搞清楚[1-5]。因此,菌種的分離鑒定是解決所有問題的基礎,作者從紅茶菌培養液中分離了其優勢菌群并用分子生物學方法對其進行鑒定,為其進一步研究發酵條件、代謝產物以及保健作用等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅茶菌菌液:作者所在公司保存;醋酸菌分離培養基:葡萄糖 20 g、酵母膏10 g、碳酸鈣20 g、瓊脂20 g、p H 6.8水1 000 m L;酵母菌分離培養基:麥芽汁瓊脂培養基;醋酸菌培養液:LB;酵母菌培養液:PB培養液。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離 平板稀釋分離法。

1)分別取5 mL培養好的紅茶菌菌液和一小塊菌膜加入45 m L無菌水稀釋,加入無菌玻璃珠,充分振蕩,使溶液混勻,然后逐次稀釋一直到10-3、10-4和 10-5。

2)分別取100μL稀釋好的菌液,涂布在醋酸菌和酵母菌分離平板上,每個濃度重復3皿。

3)酵母菌平板放在28℃下恒溫培養,醋酸菌在30℃下恒溫培養,待醋酸菌分離平板上看到透明圈,然后純化保存菌種,酵母菌分離平板上長出菌落后,挑取不一樣的菌落進行純化保存。

1.2.2 菌株的分子生物學鑒定

1)DNA的提取 分別挑取平板上生長旺盛的各個菌落接種在酵母菌或醋酸菌培養液中,待生長至對數生長期,離心取少量菌體,用 CTAB法[6]提取DNA,經瓊脂糖凝膠電泳檢測,純化后-20℃冰箱保存待用。

2)PCR擴增和測序 酵母采用26srDNA近5端D1/D2區域通用引物[7,8]。PCR擴增體系(50 μL):10×PCR緩沖液5μL,M gCl2(25 mmol/L)3 μL;dN TP(10 mmol/L)1μL;Tag(2 U/μ L)1 μL;引物(10 pmol)1μL;DNA 1μL 加超純水至50μL反應條件:95℃5 min,94℃1 min,52℃1 m in,72℃1 min 20 s 36個循環72℃8 min。

醋酸菌采用細菌16SrDNA通用引物[9,11],PCR反應體系(25μL):10×PCR緩沖液 2.5μL;M gCl2(25 mmol/L)2.0μL;dN TP(2.5 mmol/L)1.5μL;dN TP(2.5 mmol/L)1.5μL;TagDNA 聚合酶(2 U/μL)1μL引物(10μmol/L)各2μL超純水14μL。PCR反應條件為:94℃5 min,94℃30 s,55℃1 min,72℃2 min,35個循環,最后72℃保溫5 min。

所得PCR產物送上海鼎安生物科技有限公司純化,測序。將所測序列登陸 GenBank數據庫,進行BLAST比對,同時將所測序列通過Bankit提交GenBank,獲取每個序列的登錄號。

1.2.3 構建系統發育樹 將所測序列在 GenBank核酸序列數據庫中進行同源序列搜索,下載相似菌株序列,并與分離菌株的序列放在一起,用ClustalX軟件進行多序列匹配排列,通過 Neighbo r-Joining分析方法用M ega4軟件構建系統進化樹。

2 結果與討論

2.1 菌株的分離結果

采用兩種不同的培養基分別分離醋酸菌和酵母菌,結果為,在醋酸菌分離平板上共分離到1.4×107個/m L菌株,挑取周圍有透明圈并且菌落形態不一樣的菌落進行分離純化,共得到2株不同的菌株。在麥芽汁瓊脂培養基上共分離到8.3×106個/m L菌株。挑取菌落形態不一樣的菌株進行純化保存,純化得到4株不同的酵母菌。

2.2 菌株的分子生物學鑒定

將分離獲得的2株醋酸菌進行DNA提取,PCR擴增均得到 16SrDNA序列,經比對后為A.senegalensis和G.saccharivorans。在麥芽汁瓊脂平板上分離得到的酵母菌,進行DNA提取,PCR擴增均得到600 bp左右的一段序列。登陸 Genbank比對后,結果見表1。

2.3 系統發育分析

從紅茶菌菌液中共鑒定分離到4株不同的酵母菌,2株不同的醋酸菌,通過Bankit提交 Genbank獲取登錄號(表1)。將4株酵母菌的26S rDNAD1/D2區域序列與 GeneBank中的序列進行比較,選取相近的典型菌株的26S rDNAD1/D2區域序列,用 ClustalX1.8與Mega4軟件構建系統發育樹見圖1。同樣的方法2株醋酸菌構建16SrDNA序列系統發育樹見圖2。

表1 紅茶菌分離菌株的分子鑒定Tab.1 Molecular identification of strains isolated from Kombucha

從酵母菌26S rDNAD1/D2區域序列構建的系統發育樹來看,Y1和 Y2親緣關系較近,與P.membranifaciens和P.galeiform is聚在一起,在登 陸 Genbank比 對 后,Y1與P.membranifaciens相似性為 99%,同樣 Y2與P.galeiform is相似性為99%,因此,初步將 Y1鑒定為P.membranifaciens,Y2鑒 定 為P.galeiform is。同樣,Y3與D.anom ala在親緣關系上最近,Y4與Z.bailii相似性最高,將二者在分類學地位上歸于D.anom ala和Z.bailii。

從醋酸菌16SrDNA序列構建的系統發育樹可以看出,AC2與G.saccharivorans聚在一起,親緣關系較近,在分類上也將其歸為G.saccharivorans。AC1單獨形成一個分支,與A.senegalensis的遺傳距離最近,在 Genebank中比對,與他的相似性也最高為99%,因此,也將其歸為A.senegalensis。

圖1 4株酵母菌的26S rDNA區域序列系統發育樹Fig.1 Phylogenic tree of 4 strains yeasts based on 26S rDNA sequences

圖2 2株醋酸菌的16S rDNA區域序列系統發育樹Fig.2 Phylogenic tree of 2 strainsacetic bacteria based on16S rDNA

3 結 語

不同來源的紅茶菌,其菌種存在差異,作者分離得到的醋酸菌和酵母菌在屬間與報道的大體一致[3],種間略有不同。

用分子生物學方法鑒定微生物是一種快速、簡單、有效地方法。在細菌的鑒定中,16SrDNA因其在漫長的進化中具有高度的保守性,因而近幾年來被廣泛的應用于細菌的分類學研究[9-12]。同樣,酵母菌的26SrDNA中的D1/D2區域序列,可以很方便的把酵母菌區分開來。

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Isolation and Identification of Predominant Microbes from Kombucha and Phylogenic Analysis

QIAO Hong-ping1,2, SHA Da-nian＊1,JIN Tai-yi2, HANG Xiao-min1
(1.Bio-Pharmaceutical Research Institution,Shanghai JIAO DA ONLL Y CO.,L td.Shanghai 200233,China;2.School of Public Health,Fudan University,Shanghai200032,China)

In this manuscript,,the predominant microbes were isolated from Kombucha by different medium,8.3 106cfu/m L of yeasts and 1.4 107cfu/m L of acetic bacteria were obtained.There were 4 strains of yeasts and 2 strains of acetic bacteria through purified from different colonies.By molecular identified and phylogenic analyzed,the isolate AC1 was identified asAcetobactersenegalensis,AC2 asGluconacetobactersaccharivoran, Y1 asPichia membranifaciens, Y2 asPichiagaleiform is, Y3 asDekkeraanom ala, Y4 asZygosaccharom yces bailii.

Komucha,acetic bacteria,yeast,phylogenic analysis

Q 93.331

A

1673-1689(2011)04-0609-04

2010-08-17

國家863計劃項目(2007AA 10Z355)。

喬宏萍(1978-),女,山西孝義人,農學博士,主要從事應用微生物研究。Email:xiaoqiao2001@hotmail.com

＊通信作者：沙大年(1961-),男,上海人,高級工程師,主要從事保健品的開發與應用研究。Email:xxsha166@hotmail.com

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