易錯PCR技術改造擴展青霉脂肪酶*

施碧紅，李強，陳明，吳偉斌，施巧琴，吳松剛

1(福建師范大學教育部工業微生物工程研究中心，福建福州，350108)2(福建師范大學生命科學學院，福建福州，350108)

微生物脂肪酶是工業用脂肪酶的一個重要來源。工業催化上要求脂肪酶具有高的活性、穩定性以及對底物的特異性。擴展青霉(Penicillium expansum)FS1884所產堿性脂肪酶是國產商品化的堿性脂肪酶制劑，已被用于洗滌、面包加工、皮革脫脂、魚類脫脂等領域。但實際應用中仍需進一步提高該脂肪酶的熱穩定性和酶活力。擴展青霉FS1884是經過20多代物理化學誘變后的高產突變株，對各種物理化學誘變劑已產生一定的飽和效應，用傳統的誘變技術進一步改善其所產脂肪酶的性質或提高酶活已出現困難。且傳統的誘變育種方法具有篩選工作量大、突變體遺傳背景不清楚等缺點。易錯PCR(error-prone PCR)技術直接對目標蛋白質的編碼序列進行隨機突變，進而定向篩選理想性狀的蛋白質，為改良目標蛋白及解析蛋白質的結構與功能關系提供快捷途徑。大腸桿菌中，高絲氨酸－琥珀酰轉移酶(MetA)是甲硫氨酸合成途徑中第1個關鍵酶，該酶使其無法適應高溫的生長環境，Mordukhova［1］通過易錯 PCR 技術，篩選到了1株MetA的突變株，其中有5個氨基酸發生了突變:S61T，E213V，I229T，N267D和 N271K，使其能在更高的溫度下(44℃)生長。Niu［2］等通過定向進化(易錯PCR和DNA Shuffling結合)的研究方法，建立Rhizopus arrhizus脂肪酶隨機突變文庫，篩選到1株最適作用溫度提高10℃的突變株，且突變株在50℃下的半衰期比野生型脂肪酶提高了12倍。Kim［3］通過易錯PCR和重疊延伸PCR結合的方法，篩選到了1株突變體，在50℃和55℃放置2h后殘余活力分別為30%和10%，而野生型在此條件下均失去活性，突變體的耐熱性大大提高。

本研究利用易錯PCR技術對擴展青霉脂肪酶基因進行隨機突變，建立隨機突變文庫，通過高通量篩選，期望獲得脂肪酶耐熱性和酶活力都有所提高的突變株。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

Pichia pastorisGS115、pPIC3.5K，由福建師范大學林琳教授提供，E.coliJM109由本實驗室保存。pPIC3.5k-PEL為本實驗室構建并保存［4］，PEL為Penicillium expansumlipase的縮寫(下同)。

1.1.2 培養基

LB、YPD、MD、BMGY、BMMY、MM 均根據 invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit說明配制，OMM平板為MM平板加上2.5%橄欖油乳化液，橄欖油檢驗板為含有2.5%橄欖油乳化液的瓊脂板。

1.1.3 引物

引物P1，P2用于從pPIC3.5K-PEL質粒上擴增脂肪酶(PEL)基因，其設計原理見參考文獻［4］:

P3:5＇GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3＇(5’AOX引物)

P4:5＇GGCAAATGGCATTCTGACATCCT 3＇(3’AOX引物)

1.2 方法

1.2.1 脂肪酶隨機突變庫的建立

以含擴展青霉脂肪酶基因的pPIC3.5k-PEL質粒DNA為摸板，P1，P2為引物進行易錯 PCR。100μL PCR 體系如下:10 ×PCR Buffer 10 μL，dATP(100 mmol/L)0.2μL，dGTP(100 mmol/L)0.2μL，dCTP(100 mmol/L)1μL，dTTP(100 mmol/L)1μL，MgCl2(25 mmol/L)20 μL ，MnCl2(10 mmol/L)1 μL ，P1Primer(10 μmol/L)1 μL，P2Primer(10μmol/L)1μL，大量抽提 pPIC3.5k-PEL 質粒 DNA 1μL ，TaqDNA Polymerase 2 U，再加入滅菌超純水到100 μL。擴增程序為:94℃ 2 min;30×(94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min);72℃ 7 min。

PCR擴增的突變產物用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，與經相同雙酶切的pPIC3.5k連接，構建表達載體pPIC3.5k-PEL-Mut，，轉化大腸桿菌 JM109，構建突變體庫。

1.2.2 突變文庫的篩選

大量抽提突變體庫質粒，經SalⅠ線性化后電轉畢赤酵母GS115，涂布于MD平板上，用無菌牙簽挑選轉化子到含有1%橄欖油乳化液的OMM平板上進行初篩。OMM平板含有0.5%的甲醇，可誘導pPIC3.5K上的AOX啟動子，啟動脂肪酶的表達，水解橄欖油乳化液后形成水解圈。以含有野生型脂肪酶基因的畢赤酵母GS115(PEL-GS)為對照進行初篩，選擇在OMM平板上產生比野生型脂肪酶透明圈大的菌落，進行復篩。

將初篩獲得的各菌株分別接種1 mL BMMY液體培養基進行搖管發酵，30℃振蕩培養72 h，培養液經過離心后，平板檢測酶的活性，耐熱性，耐酸性等，篩選優良突變株，搖管復篩中以PEL-GS115為對照。

將搖管復篩獲得的優良突變菌株在含甲醇的BMMY培養基中進行搖瓶發酵，誘導畢赤酵母表達脂肪酶，測定脂肪酶活性和耐熱性以及最適作用溫度等。

1.2.3 表達產物鑒定

平板透明圈法檢測脂肪酶活性，在pH9.4的緩沖液中加入2%瓊脂粉，并加入2.5%的橄欖油乳化液，制成檢驗板，用打孔器打孔，每孔加入發酵液10 μL，37℃放置24 h，觀察產生的水解圈的大小。

1.2.4 脂肪酶活性的測定

以橄欖油為底物，采用NaOH滴定法［5］測定酶活力。

1.2.5 突變脂肪酶最適作用溫度

以橄欖油為底物，在 30、35、40、45、50℃下，采用NaOH滴定法分別測定PEL-GS(野生重組酶)和突變體脂肪酶(ep3-GS)的酶活，以相對酶活確定突變酶的最適作用溫度，與對照相比，觀察酶活性的提高程度。

1.2.6 突變脂肪酶熱穩定性

分別將野生重組酶PEL-GS和突變體脂肪酶在30，35，40，45，50℃ 溫育 30 min 后，迅速置冰浴 30 min，在pH9.4，35℃測定酶的殘余活力。以未經溫度處理的酶液的酶活力為100%，換算不同溫度處理后的殘余酶活百分比，制作對溫度的變化曲線，確定酶的熱穩定性。

1.2.7 突變酶的適宜反應pH值

在不同pH的橄欖油平板上，采用透明圈法分別測定突變脂肪酶與野生脂肪酶的酶活力。其中pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0橄欖油乳化平板由 K2HPO4-KH2PO4緩沖體系配制，pH 9.4及 pH 10.0橄欖油平板由甘氨酸-NaOH緩沖體系配制。分別以突變酶及野生酶的最大脂肪酶活力為100%，換算相對酶活力，以相對酶活對反應pH值作圖，確定突變脂肪酶及野生重組酶的適宜pH值。

1.2.8 正向突變株堿性脂肪酶基因的序列測定、結構預測和突變位點分析

提取高酶活的畢赤酵母突變菌株的基因組DNA［6－7］，PCR 擴增及酶切驗證突變脂肪酶基因 cDNA，由invitrogen公司進行脂肪酶基因的序列測定。在SWISSMODEL數據庫輸入突變蛋白的氨基酸序列，預測蛋白的三級結構，分析位點突變效應。

2 結果與分析

2.1 突變脂肪酶基因的獲得及突變文庫的構建

使用P1、P2為引物在優化后的易錯PCR條件下擴增擴展青霉脂肪酶cDNA片段，易錯PCR產物如圖1，條帶大小為900bp左右，符合預期大小。經純化并雙酶切的易錯PCR產物，與pPIC3.5k載體連接，轉化大腸桿菌JM109，得到了約104個轉化子的突變文庫。

2.2 突變文庫的篩選

將文庫的轉化子經 LB液體培養，抽提質粒DNA，轉化畢赤酵母GS115，涂布在MD平板，經過初篩，篩選了大約4 000株轉化了含有目的突變基因的畢赤酵母(圖2)，其中選擇了約300株進行小量的發酵實驗，經過72 h的誘導，脂肪酶在畢赤酵母中得到成功表達。分別取10 μL發酵上清液在3種不同條件的檢驗板進行酶活測定篩選，篩選1株優良突變株ep3。該突變株在橄欖油平板上透明圈達到2.2 cm。

圖1 易錯PCR產物效果圖

圖2 突變株在含橄欖油平板上的篩選

2.3 突變脂肪酶的性質

對突變株ep3產生的脂肪酶ep3-GS和野生型重組酶的表達產物(PEL-GS)進行不同溫度下酶活測定，發現突變酶的最適作用溫度與野生重組酶一致，均為35℃ (圖3)，35℃時突變酶ep3-GS的活力為3 440 U/mg，比該溫度下野生型重組脂肪酶PEL-GS的酶活提高了17%;突變酶及野生重組酶的表達量分別為0.7、0.6 mg/mL。溫度對突變脂肪酶的影響顯著，50℃時突變酶的活性僅為最適反應溫度(35℃)下酶活的30%。

圖3 ep3-GS與PEL-GS的最適作用溫度

將野生型PEL-GS與突變體脂肪酶ep3-GS分別在不同溫度放置30 min，測其殘余酶活，結果顯示，突變體脂肪酶的熱穩定性相比于野生型的脂肪酶有了一定的改善，突變體脂肪酶45℃放置0.5h殘余34%的活力，40℃放置0.5 h殘余52%的活力，均高于野生型酶的耐熱性(圖4)。

圖4 突變體脂肪酶與野生型脂肪酶的耐熱性

對突變脂肪酶ep3-GS和野生型重組酶PEL-GS在不同pH值的橄欖油平板上進行酶活測定，發現突變酶的最適pH值沒有發生明顯變化，與野生重組酶一致，為pH9.4(圖5)。

圖5 突變體脂肪酶與野生型脂肪酶的最適pH

2.4 突變脂肪酶基因的結構預測與突變位點的檢測

利用SWISSMODEL REPOSITORY對突變脂肪酶進行結構預測，發現突變脂肪酶ep3-GS的三級結構與野生型脂肪酶PEL-GS無明顯差異。測序結果顯示，脂肪酶基因的424位堿基發生突變，即A424G。突變脂肪酶一級結構發生一個氨基酸的變化，142位上的氨基酸由堿性氨基酸賴氨酸突變成酸性氨基酸谷氨酸(LYS142GLU)。

3 討論

本研究利用易錯PCR的隨機突變能力，簡單快速地在擴展青霉堿性脂肪酶基因上制造核苷酸變化，通過調節易錯PCR體系中Mn2+的濃度，調控堿基突變率，使氨基酸突變率穩定在每個基因1～2個的范圍內［8］，獲得了脂肪酶突變基因群，構建擴展青霉堿性脂肪酶基因突變文庫。同時利用脂肪酶對橄欖油的水解能力，建立了簡單、快捷、經濟的高通量平板篩選方法。在含橄欖油底物的各種平板上，直接觀察菌落周圍或酶液周圍的水解圈大小，直觀、高效地挑選不同條件下水解能力強的突變株。多個突變體篩選同時進行，提高了篩選效率。

擴展青霉堿性脂肪酶屬于α/β型水解酶，含285個氨基酸，其中前27個氨基酸為信號肽和前肽，其余258個氨基酸組成成熟肽［9］。擴展青霉脂肪酶的活性中心是由高度保守的Ser-Asp-His組成的催化三聯體，包埋在脂肪酶空間結構中央的β-折疊的環中，形成疏水環境。活性中心外有一段α螺旋形成的蓋子，在非激活狀態下掩蓋催化中心，起保護作用。脂肪酶被激活時，這個蓋子就打開，暴露活性中心［9－11］。測序結果顯示，142位的賴氨酸突變為谷氨酸(Lys142Glu)，由堿性氨基酸變為酸性氨基酸，在空間結構上，該氨基酸位于脂肪酶結構的第4個α螺旋上，該α螺旋緊靠第2個β折疊，142位的賴氨酸突變為酸性的谷氨酸，谷氨酸可與空間位置上靠近的堿性氨基酸形成鹽橋，如與第2個β折疊上63位的賴氨酸形成鹽橋，鹽橋的形成可能對α螺旋的構象翻轉起到支持作用，因而促進脂肪酶水解能力提高。

［1］ Mordukhova E A，Lee H S，Pan J G.Improved thermostability and acetic acid tolerance ofEscherichia colivia directed evolution of homoserine o-succinyl transferase［J］．Appl Environ Microbiol，2008，74(24):7 660 －7 668.

［2］ Niu W N，Li Z P，Zhang D W，et al.Improved thermostability and the optimum temperature ofRhizopus arrhizuslipase by directed evolution［J］．Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2006，43(1 －4):33 －39.

［3］ Kim J H，Choi G S，Kim S B，et al.Enhanced thermostability and tolerance of high substrate concentration of an esterase by directed evolution［J］．Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2004，27(4－6):169－175.

［4］ 李強，張建軍，蔡容華，等.擴展青霉FS1884脂肪酶基因的定點誘變及其活性分析［J］．福建師范大學學報:自然科學版，2009，25(4):105 －108.

［5］ 施巧琴.堿性脂肪酶的研究:Ⅰ菌株的分離和篩選［J］．微生物學通報，1981(3):108－110.

［6］ 高炳淼，長孫東亭，朱曉鵬，等．畢赤酵母重組子PCR模板制備方法的比較［J］．中國海洋藥物雜志，2009，28(1):7－11．

［7］ 劇海，梁東春，郭剛，等．用于PCR實驗的畢赤酵母基因組DNA制備方法的比較［J］．天津醫藥，2003，31(5):270－272．

［8］ Moore J C，Jin H M，Kuchner O，et a1．Strategies for the in vitro evolution of protein function:enzyme evolution by random recombination of improved sequences［J］．Journal of Molecular Biology，1997，272(3):336 －347．

［9］ 林琳，謝必峰，楊冠珍，等.擴展青霉PF898堿性脂肪酶cDNA的克隆及序列分析［J］．中國生物化學與分子生物學報，2002，18(1):32 －37.

［10］ Jaeger K E，Dijkstra B W，Reetz M T.Bacterial biocatalysts:molecular biology，three-dimensional structures，and biotechnological applications of lipases［J］．Annu Rev Microbiol，1999，53:315 －351.

［11］ Aloulou A，Rodriguez J A，Fernandez S，et al.Exploring the specific features of interfacial enzymology based on lipase studies［J］．Biochimica et Biophysica Acta，2006，1 761(9):995－1013.