梨果棒曲霉素產生菌的分離及ITS區鑒定*

謝芳超，劉春霖，楊相政，陳義倫

(山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安，271018)

棒曲霉素(patulin)，又稱展青霉素，是一種非揮發性的內酯類化合物，會引發過敏癥狀［1］，引起免疫、神經系統和胃腸道毒性反應、突變和胚胎毒性［2－3］，在動物模型中還可造成DNA損傷，引起動物的胃腸道功能紊亂和不同器官的水腫和出血［4－5］。食品中棒曲霉素的殘留問題已引起世界衛生組織的高度關注，對其最低限量做了嚴格規定(＜50 μg/L)，并有不斷降低的趨勢［6］。

目前，主要從兩方面控制食品中棒曲霉素產生，一是提高對已經產生的棒曲霉素的去除能力，另一方面是針對棒曲霉素產生菌，通過控制菌株的生長產毒，從源頭減少毒素的產生量。棒曲霉素已經在多種水果中檢測出來［7－11］，產生棒曲霉素的菌主要來自污染水果的真菌青霉屬(Penicillium)，曲霉屬(Aspergillus)和絲衣霉屬(Byssochlamys)［12］。梨果采后貯運過程易污染棒曲霉素產生菌，造成商品梨果及以梨濃縮汁為代表的梨加工產品棒曲霉素的污染，但污染梨果的棒曲霉素產生菌并不明確，同時缺乏實用的控制技術，本文以不同品種腐敗梨果為材料，分離棒曲霉素產生菌并對其進行形態及ITS區鑒定，以期為控制梨果產棒曲霉素、提高梨加工品安全性提供基礎理論和技術方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

萊陽仕梨、陽信鴨梨:采樣于產地，自然腐敗的梨果。

棒曲霉素標品(色譜純):FERMENTEK Ltd.提供;甲醇(色譜純)，其他試劑為分析純。

1.2 培養基

(1)分離純化培養基(PDA):馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 自然。

(2)菌種保藏培養基(CA):蔗糖3 g，K2HPO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，NaNO30.3 g，KCl 0.05 g，FeSO40.001 g，瓊脂 1.5 ～2 g，蒸餾水 100 mL。

(3)產毒培養基:現制萊陽梨梨汁(7.75 Brix，pH 4.27)，陽信梨梨汁(10.40 Brix，pH 4.37)。

1.3 儀器與設備

STI501型液相色譜儀，賽智科技(杭州)有限公司;TGC-18C型高速壹式離心機，上海安亭科技儀器廠;YSZ-H型電子顯微鏡，日本尼康公司。

1.4 棒曲霉素產生菌的分離純化及棒曲霉素的檢測

1.4.1 菌種分離與純化

(1)菌種分離:取一定質量梨果的腐爛部位，勻漿，制成10－1，10－2，10－3，10－4，10－5，10－6g/mL 的稀釋液，分別吸取200 μL進行PDA平板涂布，28℃倒置培養3～4 d。

(2)菌種純化:當分離菌株在培養基上進入生長旺盛期時，挑取不同形態霉菌菌株的孢子，在PDA培養基上作平板劃線純化，28℃恒溫條件下倒置培養。按此方法連續劃線，直至單個平板上為形態單一的菌落。挑取平板上的單菌落進行純培養，得到純菌株。

(3)菌種保藏:將純菌株接種于CA培養基中，4℃保藏。

1.4.2 產毒代謝培養

將分離得到的各個菌株進行平板純培養，用靜水壓法制備106CFU/mL孢子懸浮液，1%(V/V)接種于產毒培養基中，28℃靜置培養14天。

1.4.3 棒曲霉素HPLC檢測

參照文獻［13］對培養后的產毒培養基進行棒曲霉素HPLC檢測。

1.5 棒曲霉素產生菌的鑒定

1.5.1 菌落形態及顯微觀察

參照文獻［14］對培養7 d的棒曲霉素產生菌進行菌落形態和顯微鏡觀察并記錄。

1.5.2 棒曲霉素產生菌的分子鑒定

將棒曲霉素產生菌接種于液體CA培養基中，4～5 d后，真空濾干菌體，充分研磨后，用 OMEGA Fungal DNA Mini Kit D3390-01試劑盒進行DNA提取，之后用以下引物對菌株DNA進行ITS區 PCR擴增試驗［15］:

PCR擴增的反應體系為50 μL，其中10×buffer 5 μL;dNTP 4 μL;引物各 4 μL;Taq 酶 0.5 μL;模板 4 μL;之后用雙蒸水補足到50 μL。PCR擴增的反應條件為:94℃預變性 3 min，94℃變性 50s，50℃復性 1 min，72℃延伸1 min30s，進行35個循環，最后72℃終延伸10 min。

將PCR擴增產物送至華大測序公司進行測序，將測序結果在NCBI(National Center for Biotechnology Information)中的GenBank進行Blast比對，構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 棒曲霉素產生菌的確定

圖1和圖2分別為棒曲霉素標準品高效液相色譜圖和P-1號樣品色譜圖。由圖可知，棒曲霉素的保留時間為5.7 min。

從萊陽仕梨和陽信鴨梨腐爛果中，分離純化得到了10株棒曲霉素產生菌，其代謝產物經HPLC檢測均含有棒曲霉素，各菌株編號、代謝產物中棒曲霉素的含量和菌株來源見表1。由表1可知，10株菌產棒曲霉素的能力不同，其中P-1菌株產毒量最高，達2530.0 μg/L;P-10 菌株的產毒量最低，為 89.9 μg/L，但均超過了世界衛生組織對食品中棒曲霉素最低限量50 μg/L的要求。因此，所得到的10株菌均為梨果生產加工中嚴重危害食品安全的棒曲霉素產生菌。

圖1 棒曲霉素標準品高效液相色譜圖

圖2 P-1樣品檢測圖譜

表1 棒曲霉素產生菌產毒素含量

2.2 棒曲霉素產生菌形態學鑒定

圖3為P-1菌株的菌落形態及顯微結構的圖片。棒曲霉素產生菌形態學鑒定結果見表2。經形態學初步鑒定，P-1，P-2，P-3，P-5，P-6，P-8，P-10 菌株為青霉屬，P-4，P-7號菌株屬曲霉屬，P-9號菌株為鐮刀屬菌種。對分離的10株菌進行分子生物學分類鑒定，進一步確定其分類地位。

2.3 棒曲霉素產生菌分子鑒定

2.3.1 序列比對結果與分析

圖3 P-1菌株的菌落形態

利用真菌試劑盒提取10株產毒素菌的DNA，PCR擴增后，將PCR產物送至北京華大基因進行測序，利用DNAMAN將測序結果進行拼接，拼接結果在Genank中進行Blast比對，得到同緣性最高菌，結果見表3。由表可知，P-1菌株Penicilliumsp.8-9，P-2菌株Penicillium purpurogenumstrain F43，P-3菌株Penicilliumsp.4382，P-5菌株Penicillumsp.3 TMS-2011 voucher BGd100p3-1，P-6菌株Penicillium funiculosumisolate NG_p14，P-8 菌株Penicillium polonicumstrain F5和P-10菌株Penicilliumsp.12-20為青霉屬，P-4菌株Aspergillussp.CRCF11，P-7菌株Aspergillus versicolorstrain A11.2為曲霉屬，P-9菌株Fusariumsp.NRRL44904為鐮刀屬菌種。

表2 棒曲霉素產生菌培養7天形態學主要特征

表3 菌株比對結果

2.3.2 系統發育樹的構建

10株棒曲霉素產生菌的系統發育樹結果見圖4。

由此圖4可知，10株菌從進化關系上分為兩大類群，P-9 為一類群，P-1，P-2，P-3，P-4，P-5，P-6，P-7，P-8，P-10為另一類群。在另一類群中P-4與P-7，P-8在同一分支上，親緣關系為84%;P-4和P-8為同一分支，親緣關系 76%;P-1，P-2，P-3，P-5，P-6，P-10 在同一分支上，親緣關系為96%。

3 小結

圖4 10株棒曲霉素產生菌的系統發育樹

(1)本次試驗共篩選出萊陽仕梨及陽信鴨梨腐敗梨果中棒曲霉素產生菌10株;對產生菌的形態及ITS區域進行了鑒定，結果表明:7株為青霉屬，2株為曲霉屬，1株為鐮刀菌屬;此10株菌的進化發育關系為:P-9為一類群，其他9株菌為一類群，其中P-4與 P-7，P-8 在同一分支上，P-1，P-2，P-3，P-5，P-6，P-10同在另一分支上。

(2)本次實驗分離出的10株棒曲霉素產生菌中，青霉屬菌與其他菌屬相比為優勢菌群，應用形態學和分子測序的方法初步確定了其菌群的生物學分類;篩選出產毒能力最強的P-1菌株可作為毒素控制的主要對象進一步研究。

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