響應曲面法優化母乳化結構油脂制備工藝

彭莉娟，趙春江，高汪磊，胡菲菲，王春芳，馮鳳琴

(浙江大學生工食品學院，浙江杭州，310058)

母乳是嬰兒最佳的天然食品。在嬰幼兒的發育過程中，母乳脂肪不僅為其提供超過50%的能量，而且富含各種生理活性物質，能提供給嬰兒全面、充足的營養。在母乳中，組成母乳脂肪的脂肪酸中最多的是油酸(C18∶1)和棕櫚酸(C16∶0)，通常占總脂肪酸的40%和16%左右，棕櫚酸主要分布在甘油三酯的甘油主鏈的中間碳上，即Sn-2位(約為總棕櫚酸的70%)，而油酸主要分布在甘油三酯Sn-1和Sn-3位，由于人體內胰脂酶能特異性地水解甘油三酯Sn-1，3位的脂肪酸，因此，母乳脂肪主要以Sn-2棕櫚酸甘油單酯和游離油酸的形式被吸收。近年來的研究表明［1］，具有這種特殊結構特征的甘油三酯，能使嬰幼兒最大限度地吸收利用鈣質和能量，這不僅對嬰幼兒的發育至關重要，而且顯著地降低了嬰幼兒發生便秘、腹痛和腸梗阻的可能性。目前，嬰幼兒配方奶粉中使用的是混合植物油，與母乳脂肪相比，雖然混合植物油可能含有相同比例的棕櫚酸和油酸，但脂肪酸在甘油上的分布位置并不相同。植物油中含有的棕櫚酸主要分布在Sn-1，3位，而油酸主要分布在Sn-2位［2］，在人體消化過程中，Sn-1，3位的脂肪酸優先水解，產生的游離棕櫚酸會和鈣形成不溶的皂，不但會引起嬰幼兒便秘，而且導致脂肪酸和鈣質的損失［3］。

發達國家在20世紀90年代即研究開發了母乳化結構油脂，并廣泛地應用于嬰幼兒配方奶粉。而我國對母乳化結構油脂的研究和應用起步較晚，制備高質量母乳化結構油脂應用于嬰幼兒配方奶粉中以改善嬰兒健康狀況迫在眉睫。

我國有豐富的豬油資源，但并未得到有效應用，研究發現，豬油的Sn-2位富含棕櫚酸［4］，與母乳脂肪相似。本文通過Sn-1，3專一性脂肪酶催化豬油與游離脂肪酸進行酶促酯交換來合成母乳化結構油脂，采用單因素試驗和響應面分析，得到制備母乳化結構油脂的最佳工藝條件。

1 材料和方法

1.1 主要材料

豬油為實驗室熬制，母乳來自杭州市健康哺乳母親。

Lipozyme RM IM，諾維信公司;豬胰脂酶，Sigma公司;月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、十七酸，均分析純，Sigma公司;Sn-1，3位置專一性脂肪酶Lipozyme RM IM，Sigma公司，正己烷，色譜純，上海化學試劑公司;2，7-二氯熒光素，西域科技(中國);膽酸鈉，Sigma公司;tris緩沖液，上海傳信化工有限公司;乙醚、氯化鈉、甲醇、氫氧化鉀、三氯甲烷、無水碳酸鈉、鹽酸、氯化鈣、石油醚(60～90℃)，均為分析純。

1.2 主要儀器

SBXZ-1型旋轉蒸發儀，上海玻璃廠;GC-14C型氣相色譜儀，日本島津公司，配氫火焰離子化檢測器(FID);THZ-82水浴恒溫振蕩器，金壇市精達儀器制造廠;sep-pak柱，上海泉島公司;硅膠，GF254青島海洋化工有限公司;試管渦旋震蕩器，江蘇海門市其林爾儀器制造有限公司;SB-2型薄層色譜噴霧泵，天津市天分分析儀器廠。

1.3 試驗設計

根據文獻及預試驗，溫度、底物比、加酶量和時間對酯交換結果影響較大，因此，首先通過單因素試驗確定酶促酯交換反應的最適反應溫度、底物比、加酶量和反應時間。

1.4 試驗方法

一定量豬油與酰基供體置于50 mL的圓底燒瓶中，在一定溫度的水浴中使其溶解，再加入一定量固定化脂肪酶，反應一定時間后，真空抽濾除去酶，對產物進行分析。

1.5 脂肪酸含量測定

1.5.1 產物中甘油三酯分離

取0.02 g產物溶于0.5 mL正己烷中，進行薄板層析，刮取甘油三酯條帶，進行脂肪酸成分分析。

1.5.2 薄層色譜分析

用薄層色譜分離甘三酯、甘二酯、甘一酯以及脂肪酸。展開劑:V(正己烷)∶V(乙醚)∶V(乙酸)=70∶30∶1;顯色劑:0.1%2，7-二氯熒光素。各組分的Rf分別為:甘一酯Rf=0.02，1，2-甘二酯Rf=0.22，1，3-甘二酯Rf=0.31，脂肪酸Rf=0.50，甘三酯Rf=0.69，固醇Rf=0.81。

1.5.3 總脂肪酸含量測定

脂肪酸甲酯化采用GB-T 17376－2008法。

1.5.4 產物sn-2位脂肪酸組成分析

sn-2位脂肪酸組成分析按GB-T 24894－2010法。

1.5.5 脂肪酸含量的氣相色譜分析

色譜條件:DB-23毛細管色譜柱(柱長60m，內徑0.25mm，液膜厚度0.25mm):Agilent公司;汽化室溫度:270℃;檢測器溫度:270℃;載氣:高純氮;柱流速:1.0 mL/min;尾吹流速:40 mL/min;氫氣流速:35 mL/min;空氣流速:350 mL/min;進樣量:2μL，分流進樣，分流比40∶1;柱溫采用程序升溫方式:100℃(保10 min)→180℃(20.0℃/min，保持10 min)→220℃(10.0℃ /min，保持7 min)→230 ℃(20.0 ℃/min，保持4 min)。使用浙江大學N2010進行數據采集和分析，采用面積歸一化法計算。

2 結果與討論

2.1 豬油及母乳脂肪酸組成

實驗測得，豬油及母乳脂肪酸組成如表1所示。比較發現，豬油與母乳脂肪相似，其Sn-2位均富含棕櫚酸，因此，豬油較適合作為母乳化結構油脂的生產原料，本研究通過酸解反應，對豬油的Sn-1和Sn-3位脂肪酸重組，使其富含油酸，并在組成比例上盡可能接近母乳脂肪。

表1 豬油及母乳脂肪酸組成(%mol)

2.2 單因素試驗分析

2.2.1 反應時間對豬油酶促酯交換制備母乳化結構油脂的影響

酰基供體與豬油按摩爾比1∶2配制，酰基供體依母乳脂肪酸組成調配而成。在60℃的水浴中使其溶解，加入底物質量10%的Sn-1，3專一性脂肪酶，分別反應 0.5、1、1.5、2 h，取樣測定脂肪酸組成，結果見圖1。由圖1可知，反應1 h后，棕櫚酸和油酸含量分別達到最大值，分別為16.78%、40.88%，亞油酸含量為16.75%，硬酯酸的含量降到7.65%，其他各種酸亦接近人乳脂的含量，因此，反應時間選擇1 h較合適。

圖1 時間對產物中各種脂肪酸含量的影響

2.2.2 溫度對豬油酶促酯交換制備母乳化結構油脂的影響

酰基供體與豬油按摩爾比2∶1配制，在一定溫度的水浴中使其溶解，加入底物質量10%的Sn-1，3專一性脂肪酶，分別在50、60、70、80℃的水浴中反應1 h，取樣測定脂肪酸組成，結果見圖2。由圖2可知，在溫度為60°C時，棕櫚酸含量達到16.84%，油酸含量為40.48%，亞油酸含量為20.51%，硬脂酸含量降低到6.65%，接近母乳脂肪的含量，當反應溫度超過60°C時，各種脂肪酸含量稍有下降，故Lipozyme RM IM酶的最適反應溫度為60℃。

圖2 溫度對產物中各種脂肪酸含量的影響

2.2.3 加酶量對豬油酶促酯交換制備母乳化結構油脂的影響

酰基供體與豬油按摩爾比2∶1配制，在60°C的水浴中使其溶解，分別加入底物質量1%、5%、10%、15%的sn-1，3專一性脂肪酶，在60°C的水浴中反應1 h，取樣測定脂肪酸組成，結果見圖3。由圖3可知，在加酶量為10%時，棕櫚酸含量達到最大值16.96%，油酸含量為 40.95%，亞油酸含量為19.23%，硬脂酸含量降低到5.52%，接近母乳脂肪的含量，當酶量超過10%時時，各種脂肪酸含量變化不大，考慮到成本問題，故最適加酶量為10%。

圖3 加酶量對產物中各種脂肪酸含量的影響

2.2.4 底物比對豬油酶促酯交換制備母乳化結構油脂的影響

酰基供體與豬油按摩爾比 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1 配制，在60°C的水浴中使其溶解，分別加入底物質量10%的Sn-1，3專一性脂肪酶，在60°C的水浴中反應1 h，取樣測定脂肪酸組成，結果見圖4。由圖4可知，在底物比為2∶1時，棕櫚酸和油酸含量均達到最大值，分別為 16.42%、40.83%，亞油酸含量為18.01%，硬脂酸含量降低到6.52%，接近母乳脂肪的含量，隨著底物比的加大，各種脂肪酸的含量稍有上升，但從經濟效益出發，底物比2∶1是最佳選擇。

圖4 底物比對產物中各種脂肪酸含量的影響

2.3 響應曲面法優化豬油酶促酯交換制備母乳化結構油脂的工藝試驗

在單因素試驗確定酯交換反應的最適反應溫度同，底物比，反應時間，酶/底物的基礎上，據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，以溫度、底物比、酶/底物、反應時間為自變量。以產物Sn-2位棕櫚酸分布(Sn-2棕櫚酸/總棕櫚酸)為響應值(Y)，設計四因素三水平共29個試驗點的響應面分析試驗，建立二次多項式回歸模型，試驗因素水平與編碼如表2所示。

編碼 (A)溫度/℃(B)底物比(酰基供體與豬油摩爾比)(C)反應時間/h(D)酶量(以底物計)/%－1 55 1.5∶1 0.75 9 0 60 2∶1 1 10 1 65 2.5∶1 1.25 11

設該模型通過最小二乘法擬合的二次多項方程為:

式中:Y為預測響應值;X0為常數項;X1、X2、X3、X4為線性系數;X12、X13、X14、X23、X24、X34為交互項系數;X11、X22、X33、X44為二次項系數。

按照Box-Behnken試驗設計的統計學要求，對方程(1)中各項回歸系數需要29組試驗進行回歸擬合，實驗設計及結果見表3。

表3 Box-Behnken實驗設計及響應值的實測和預測值

利用Design Expert軟件，通過表3中的試驗數據對方程(1)進行多元回歸擬合獲得Sn-2棕櫚酸/總棕櫚酸(Y)對編碼自變量溫度(A)、底物比 (B)、酶/底物(C)和反應時間(D)的二次多項回歸方程:

由表4方差分析結果可以看出，本試驗所選用的二次多項模型極顯著(Pmodel＜0．000 1)，方程的失擬項不顯著(P=0.254 6)，說明各因素值和響應值之間的關系可以用此模型來函數化。相關系數r2=0.984 2，表明Sn-2棕櫚酸分布的實測值與預測值之間具有較好的擬合度［5－6］。其校正決定系數R2=0.968 4，表明僅有約3.2% 的Sn-2棕櫚酸分布的總變異不能由此模型進行解釋。

從4個因素對Sn-2棕櫚酸分布的影響來看，回歸方程的一次項A、B、C和D對Sn-2棕櫚酸分布的線性效應顯著，且影響順序為A、B＞C＞D;二次項A2、B2、C2和D2均對Sn-2棕櫚酸的曲面效應顯著;溫度和反應時間(0.027 5)的交互作用顯著，而其他兩因素間的交互作用不顯著，其交互作用的響應曲面圖如5～圖10。

表4 Sn-2位棕櫚酸分布回歸方程方差分析及顯著性檢驗

圖5 溫度和底物比的交互作用圖

對擬合方程求偏導，可以得到模型的極值，即為最大的Sn-2棕櫚酸分布。為了求解最大值，解方程(2)得到:反應溫度60.42°C;底物比酰基供體與豬油摩爾比1∶2.08摩爾比);反應時間 1.05 h，酶/底物10.15%，。采用上述優化后的條件對試驗結果進行驗證，共進行3次重復實驗，測得合成產物Sn-2棕櫚酸分布平均值為70.92%，與理論預測值基本吻合。

圖6 溫度和反應時間的交互作用圖

圖7 溫度和加酶量的交互作用圖

圖8 底物比和反應時間的交互作用圖

圖9 底物比和加酶量的交互作用圖

3 結論

圖10 反應時間和加酶量的交互作用圖

通過單因素試驗和Box-Behnken響應面分析試驗，建立了豬油酶促酯交換制備母乳化結構油脂的數學模型，并以此模型進行優化，得到的最佳制備工藝:反應溫度60.42°C;底物比(酰基供體與豬油摩爾比)2.08∶1;反應時間 1.05 h，酶/底物 10.15%，在此條件下合成產物中Sn-2棕櫚酸分布為70.92% ，與理論預測值基本吻合。說明采用RSM優化得到的酶促酯交換工藝條件參數準確可靠，按照建立的模型進行預測在實踐中是可行的。本實驗為研制國內類似母乳脂肪的“結構油脂”提供科學依據，為更加合理喂養嬰兒促進其健康成長提供理論基礎。

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