應用HS-SPME技術分析葡萄果皮與果肉揮發性香氣物質*

范文來，徐巖，李記明，，姜文廣，，于英

1(教育部工業生物技術重點實驗室，江南大學釀酒科學與酶技術研究中心，釀造微生物與應用酶學研究室，江蘇無錫，214122)2(張裕集團公司技術中心，山東煙臺，264000)

揮發性香氣成分是葡萄中重要的風味物質，其種類繁多，主要包括酸類、醇類、酯類、萜烯類、醛酮類和酚類等［1］。這些成分的種類、含量、感覺閾值及其之間的相互作用決定著葡萄的感官質量，也影響著葡萄酒的風味和典型性［2］。不同葡萄品種，乃至同一品種不同品系、不同成熟期和不同產地之間風味成分存在著差異。蛇龍珠(Cabernet gernischt)、赤霞珠(Cabernet sauvignon)、品麗珠(Cabernet franc)和梅鹿輒(Merlot)葡萄是我國釀造紅葡萄酒的主要葡萄品種，我國科研人員對這些葡萄品種的香氣研究十分廣泛，而對蛇龍珠葡萄的研究相對較少［2－3］。

紅葡萄酒發酵是帶皮發酵，其主要目的是浸出皮中的色素和丹寧［4］。近期的研究發現，葡萄皮中除了含有大量的色素和丹寧外，還含有大量的風味化合物［5］。Cabaroglu等人研究了麝香葡萄(Muscat)酒的游離與結合態風味，并對浸皮發酵時間進行了研究，發現浸皮發酵時能增加總游離與結合態風味化合物濃度［6］。Sánchez-Palomo 等人應用頂空-固相微萃取(HS–SPME)方法快速檢測麝香葡萄的葡萄汁和果皮揮發性成分，發現里哪醇、香葉醇、橙花醇含量最高［7］。Cabrita等人曾經應用酶和酸水解法研究了包括10個葡萄品種(5個白葡萄和5個紅葡萄品種)的果皮與果肉的結合態香氣成分，認為葡萄果皮比果肉含有更多的香氣成分［8］。Murat等人在研究赤霞珠和梅鹿輒葡萄中3-甲硫基-1-己醇(3MH)及其前驅物時發現，該化合物60%存在于葡萄皮中;延長果汁與果皮接觸時間可以增加果汁中3MH的濃度，溫度升高有利于3MH的浸出［9］。

由于大多數的揮發性物質在葡萄中的含量很低，因此在應用色譜-質譜技術對其進行定性、定量分析前，有必要采用適宜的濃縮富集手段對樣品進行預處理。傳統的富集手段包括液液萃?。?0］、固相萃取［11］、頂空技術［12］、吹掃捕集技術［13］、超臨界流體萃?。?4］和溶劑蒸餾萃取［15］等。這些預處理手段都存在一定的缺點，有些耗時費力，有些涉及到有毒的有機溶劑，有些需使用昂貴的設備［16］。1990年，Pawliszyn等人［17］研發出了固相微萃取技術(簡稱SPME)。目前，該技術已經在酒類分析檢測中得到廣泛應用［2，18－19］。

與國外略有不同的是，我國釀酒葡萄以蛇龍珠、赤霞珠、品麗珠和梅鹿輒為主，特別是我國特有的品種蛇龍珠研究較少。為明晰我國主要釀酒葡萄的風味成分，特別是果皮與果肉的風味成分，應用 HSSPME技術對這4種葡萄的果皮與果肉成分進行研究，以便對紅葡萄酒的浸皮發酵提供技術指導，提高我國國產葡萄酒的品質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

1.1.2 試劑

主要試劑包括乙酸乙酯(99%)，丁酸乙酯(99%)，2-甲基丁酸乙酯(99%)，正丁醇(99%)，3-甲基丁醇(99%)，己酸乙酯(99%)，己醇(99%)，順-3-己烯-1-醇(99%)，辛酸乙酯(99%)，乙酸(99%)，2-乙基-1-己醇 (99%)，苯甲 醛 (99%)，正 辛醇(98%)，癸酸 乙酯 (99%)，萘 (99%)，苯乙 酮(99%)，苯甲酸乙酯(99%)，正癸醇(98%)，香茅醇(98%)，己酸 (99%)，苯甲醇 (99%)，γ-壬內酯(98%)，對乙基苯酚(98%)，3-甲基丁醛(97%)，乙偶姻(98%)，1-辛烯-3-醇(98%)，里哪醇(98%)，順，反-2，6-壬二烯醛(98%)，4-萜品醇(99%)，苯乙醛(97%)，正壬醇(98%)，α-萜品醇(98%)，2-羥基苯甲酸甲酯(97%)，β-苯乙酸乙酯(99%)，茴香腦(97%)，β-大馬酮(98%)，β-紫羅蘭酮(99%)，苯酚(98%)，4-甲基苯酚(96%)，苯甲酸(97%)，香草醛(98%)和乙酰香草酮(98%)購自Sigma-Aldrich公司(St．Louis，MO，USA)。2-辛醇 (96%)，異戊酸(98%)，2-苯乙醇(99%)購自 Fluka 公司(Bush，Switzerland)。異丁酸(99%)購自 Alfa Aesar公司(Ward Hill，MA，USA)。辛酸(98%)購自吳江慈云香料香精有限公司。乙醇購自美國 TEDIA試劑公司，液相色譜純。己醛(98%)，癸醛(99%)購自北京北大正元科技有限公司。

1.2 儀器與設備

6890N-5975氣相色譜質譜聯用儀，美國Agilent公司;50 μm/30 m CAR/DVB/PDMS(2 cm)萃取頭，美國Supelco公司;SPME手動進樣手柄，美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

1.3.1.1 葡萄果皮

?。?0℃儲藏的葡萄樣品100 g，在冷凍狀態下用手撥下葡萄皮，用去離子水輕輕沖去果皮上附著的果肉和果汁，用濾紙吸干葡萄皮上的水分。稱取2 g葡萄皮裝入50 mL的磨口三角瓶中，再加入10 mL模擬葡萄汁(煮沸去離子水中用酒石酸調pH3.5)，超聲波浸取一定時間，然后取8 mL葡萄汁到15 mL的棕色頂空瓶中，加 2.4g NaCl、4 μL 2-辛醇(內標)，蓋緊頂空瓶蓋，用于GC-MS檢測。

1.3.1.2 葡萄果肉

在互聯網社會，其最突出的特點就是整合了產業鏈的各種特色。以運營商為中心，產業鏈中的每一個廠商都有屬于自己的業務，同時也在向上游、下游延伸和滲透，每個廠商的定位越來越模糊。而諾基亞卻沒能夠抓住這一點，其沒有主動與產業鏈中的各個環節主動合作，也就沒能形成自己的影響力。

?。?0℃儲藏的葡萄樣品100 g，在冷凍狀態下用手撥下葡萄皮，果肉中加1 g CaCl2和少許液氮進行破碎，破碎后4℃下5 000 r/min離心10 min，然后取8 mL葡萄汁加入到15 mL的棕色頂空瓶中，加2.4 g NaCl和 4 μL 2-辛醇(內標)，蓋緊頂空瓶蓋，用于GC-MS檢測。

1.3.2 標準溶液配制

準確稱取一定量標準品配制到無水乙醇(優級純，上海國藥集團)中配成一定濃度的標準樣品，再加入到模擬葡萄汁中配制成一系列濃度的標準混合溶液。模擬葡萄汁采用煮沸的去離子水配制，用酒石酸將pH值調整到3.5。內標溶液為2-辛醇溶于無水乙醇中。

1.3.3 HS-SPME與定量方法

HS-SPME萃取條件與定量方法采用Fan等人的方法［2］，萃取時采用 CAR/DVB/PDMS三相萃取頭，預熱5 min，60℃下萃取45 min。

1.3.4 GC-MS

GC條件:色譜柱為DB-Wax(30 m ×0.25 mm× 0.25 μm，Agilent)。進樣口溫度 250℃，載氣 He，流速2 mL/min，檢測器溫度250°C。程序升溫:初始溫度50°C保持1 min，以6°C/min的速度升溫至230 °C，保持 15 min，溶劑延遲3 min。

MS條件:EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 °C，掃描范圍33.00～500.00 amu。

1.3.5 甲氧基吡嗪檢測方法

甲氧基吡嗪的測定參照文獻［20］。

1.3.6 物質鑒定及定量分析

物質定性采用將未知物的圖譜與NIST Library和Wiley Library庫相比較，保留匹配度大于800(最高值為1000)的物質作為化合物定性鑒定結果。除此以外，檢索結果還與已報道的保留時間進行對比驗證。

定量時每種待測物質分別對應于內標作標準曲線，經過GC-MS檢測后利用待測物質和內標的相對峰面積比代入相對應的標準曲線方程計算出待測物質的含量。每種待測物質的峰面積采用選擇離子方法積分(SIM)。

2 結果與討論

2.1 葡萄果皮中風味物質超聲波輔助萃取

果皮中含有大量風味化合物，但浸出困難。為縮短浸出時間，采用超聲波輔助浸出，樣品分別超聲10、20、30和40 min，研究超聲時間對浸出效果的影響。結果如圖1所示，在20 min后香氣成分的總峰面積基本趨于平衡。因此，果皮浸出時間設定為超聲波輔助萃取20 min。

圖1 葡萄果皮超聲浸提時間的優化

2.2 葡萄果皮與果肉風味化合物總量

在4種葡萄中，果皮中的化合物總量高于果肉中的化合物總量(見表1)，這一結果與 Selir［21－22］和 Cabrita［8］的研究結果是一致的。就研究的10類化合物總量而言，果皮的含量是果肉的1.64～21.07倍。果皮中含有較多的酯類、芳香族化合物、揮發性有機酸和揮發酚，這些化合物果皮比果肉中高出10倍以上。

不同品種的葡萄中，果皮中高含量化合物是不一樣的。在所研究的4種葡萄中，赤霞珠葡萄果皮中化合物含量較高，而蛇龍珠葡萄的果皮與果肉成分相差較小。梅鹿輒葡萄的果皮中含有較多的酯類與芳香族化合物;赤霞珠葡萄果皮中含有大量的揮發性有機酸和揮發酚;品麗珠葡萄中含有較多的揮發酚、芳香族化合物和揮發性有機酸;而蛇龍珠葡萄果皮中主要是芳香族化合物。

表1 四種葡萄果皮與果肉風味化合物濃度比

2.3 葡萄果皮與果肉中的主要揮發性風味化合物

不同的風味化合物在葡萄果皮與果肉中含量差別較大。葡萄果皮中含有較多的辛酸乙酯、2-己烯酸甲酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、辛醛、癸醛、異戊醇、苯甲醛、萘、乙酰苯、水楊酸甲酯、乙酸、里哪醇、茴香腦、己醛、2-己烯醛、順-3-己烯-1-醇、苯酚和 3-異丁基-2-甲氧基吡嗪(見表2)。

表2 四種葡萄果皮和果肉中香氣成分的含量(g/100 g)

續表2

不同品種葡萄果皮中主要風味成分濃度是不一樣的。梅鹿輒葡萄果皮中含有較多的辛酸乙酯、2-己烯酸甲酯、癸酸乙酯、己酸乙酯，是果肉的10倍以上;赤霞珠與品麗珠葡萄皮中含有較多的乙酸;梅鹿輒與赤霞珠葡萄皮中含有較多的癸醛，而品麗珠葡萄皮中含有較多的辛醛;梅鹿輒與品麗珠葡萄皮中含有大量的異戊醇;苯甲醛主要存在于梅鹿輒、赤霞珠和品麗珠葡萄的皮中;而乙酰苯和水楊酸甲酯主要存在于梅鹿輒、品麗珠與蛇龍珠葡萄果皮中，果肉中相對較少。對萜烯類化合物而言，里哪醇大量存在于赤霞珠葡萄的果皮中，而茴香腦、(S)-3-乙基-4-甲基戊醇、萘在研究的4種葡萄皮中含量遠高于果肉(10倍以上)。3-異丁基-2-甲氧基吡嗪主要存在于品麗珠與蛇龍珠葡萄果皮中。

3 結論

通過對蛇龍珠、赤霞珠、梅鹿輒和品麗珠4種葡萄果肉和果皮中香氣成分的定量和定性分析，結果表明果皮中各香氣成分的含量大約是果肉中的1.58～20.54倍左右。果皮中含有較多的酯類、芳香族化合物、揮發性有機酸和揮發酚。

與果肉成分相比，梅鹿輒葡萄果皮中主要含有辛酸乙酯、2-己烯酸甲酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、癸醛、異戊醇、苯甲醛、乙酰苯、水楊酸甲酯和2-己烯醛。赤霞珠葡萄皮中含量高的化合物有癸醛、苯甲醛、乙酸、里哪醇和順-3-己烯-1-醇。品麗珠葡萄皮中主要有辛醛、異戊醇、苯甲醛、乙酰苯、水楊酸甲酯、乙酸、2-己烯醛和3-異丁基-2-甲氧基吡嗪;而蛇龍珠葡萄果皮中主要是水楊酸甲酯、茴香腦、己醛、2-己烯醛和3-異丁基-2-甲氧基吡嗪。茴香腦、(S)-3-乙基-4-甲基戊醇、苯酚、萘在研究的4種葡萄皮中含量遠高于果肉。

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