靈芝孢子粉多糖的PMP-HPLC指紋分析*

王浩豪，戴軍，陳尚衛，朱松

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

靈芝［Ganoderma lucidum(leyss．ex．fr．)karst］是真菌門，擔子菌綱，多孔菌科，靈芝屬的真菌，是我國傳統的食藥兩用真菌［1－2］。廣義上的靈芝包括靈芝屬的所有種類，狹義上則指最常見的赤芝品種［3］。靈芝孢子(Ganoderma lucidumspore，一般來源于赤芝)是其子實體成熟期從菌蓋彈射出來的靈芝種子，凝聚了靈芝的精華。由于現代科學研究證實靈芝確具有顯著的抗衰老、抗腫瘤、降血糖、免疫調節等多種生理功效［4－9］，加之我國悠久的靈芝文化傳承，故近年來有關靈芝及靈芝孢子粉的研究和市場開發十分火熱。但因缺乏科學有效的檢測方法和質量標準，大量人工培育生產的靈芝孢子粉、子實體和菌絲體及其加工產品的質量良莠不齊，難以對其進行有效控制和鑒別［10－13］。因此，本文擬針對靈芝孢子粉的主要功效成分——多糖類物質，根據其部分水解產物與組成及結構相關(組成及結構又與其活性和質量相關)的思路和多糖大分子難以直接高效分離和檢測的特點，首次采用部分酸水解耦合柱前PMP衍生化－反相HPLC［14］分析方法檢測和表征其特性，通過若干有代表性的不同來源的靈芝孢子粉及其他不同部位和不同品種的靈芝類樣品中多糖組分的指紋分析研究，構建了靈芝孢子粉多糖的HPLC標準指紋圖譜，比較了不同部位和不同品種的靈芝類樣品中多糖組分的指紋特征及差異，以期用于實際樣品的質量監控和鑒別檢測。

1 實驗部分

1． 1 儀器與試劑

1．1．1 儀器

Agilent1100液相色譜系統，全自動進樣器，二極管陣列檢測器(DAD);Agilent1100色譜工作站。

1．1．2 試劑及樣品

單糖標準品:葡萄糖(Glc，99%)、甘露糖(Man，99%)、半乳糖(Gal，≥99%)，均購于上?；瘜W試劑公司;鼠李糖(Rha，≥99%)、巖藻糖(Fuc，≥99%)、葡萄糖醛酸(GlcUA，≥99%)、半乳糖醛酸(GalUA，≥97%)，均為美國 Sigma-Aldrich公司產品;木糖(Xyl，98%)、氨基葡萄糖(GlcN，98%)、氨基半乳糖(GalN，99%)，均為美國 ACROS ORGANICS公司產品;核糖(Rib，＞99．0%)、阿拉伯糖(Ara，99%)，均購于廈門星隆達生化試劑有限公司。衍生化試劑:1-苯基-3-甲基-5-吡唑琳酮(PMP)，純度99%(美國Acros Organics公司);乙腈，HPLC級(美國 Tedia公司);三氟乙酸(TFA)，純度不低于99%(國藥集團化學試劑有限公司)。水，超純級;其它試劑均為分析純。

靈芝孢子粉樣品:15個批號分別采自山東、安徽、福建、吉林、湖北、浙江等不同產地。

1． 2 實驗方法

1．2．1 靈芝孢子粉多糖的提取

準確稱取破壁靈芝孢子粉樣品2g于250 mL三角瓶中，加入150 mL超純水，于水浴70℃超聲50 min(功率300 W)，冷卻后離心，殘渣用少量超純水洗滌并離心后，將2次上清液合并，超純水透析24 h，55℃真空濃縮近干，加超純水溶解并定容至10 mL，待測。

1．2．2 多糖部分酸水解

吸取500μL上步所得的粗多糖水溶液于5 mL的具塞刻度試管中，加入500 μL的0．5 mol/L三氟乙酸(TFA)，充N2封管，沸水浴100℃水解1 h;冷卻后打開蓋，真空干燥或加入等體積甲醇后用N2吹干，以去除TFA，再加1 mL超純水溶解水解產物，備用。

1．2．3 PMP 衍生化

取水解后的樣品液(或混合單糖標液，各單糖質量濃度均為0．3 g/L 左右)100μL，與100μL 0．6 mol/L的NaOH溶液混勻。取其混合液50μL于5mL具塞試管中，再加50μL 0．5 mol/L的PMP甲醇溶液，漩渦混勻，同樣在70℃的烘箱中反應100 min，取出放置冷卻至室溫;加60μL 0．3 mol/L的HCl中和，加水至1 mL，再加等體積1mL的氯仿，振搖，靜置，棄去氯仿相，如此萃取3次。將水相用0．45μm微孔膜過濾后供HPLC進樣分析。

1．2．4 色譜條件

色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18，250mm ×4．6 mm i．d．，5μm;流動相:0．1 mol/L 磷酸鹽(pH 6．7)緩沖液-乙腈 (體積比為82∶18);柱溫:30℃;檢測波長:245 nm;流速:0．8 mL/min;進樣體積:50μL。

2 結果與討論

2． 1 方法學考察

2．1．1 糖對照品分析

靈芝孢子粉多糖部分酸水解后產生較多的單糖組分(見表1和圖2)，為定性指紋圖譜中這些單糖峰，選取天然多糖中常見的12種單糖制備成混合標準溶液，進樣分析得到色譜圖見圖1。由圖1可見，12種單糖分離較好，完全能滿足指紋圖譜定性要求。

圖1 12種單糖-PMP衍生物的HPLC圖譜

2．1．2 穩定性試驗

取經提取、水解和衍生化處理后的13號靈芝孢子粉多糖樣品溶液在室溫下保存，分別于0，5，10，15，20，25h測定，對各共有峰的相對保留時間(以葡萄糖的保留時間為參照)和相對峰面積(占總峰面積百分比)進行統計。結果表明，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積基本一致，RSD＜3%，表明靈芝孢子粉多糖的指紋圖譜穩定性試驗符合要求。

2．1．3 儀器精密度

取經提取、水解和衍生化處理后的13號靈芝孢子粉多糖樣品溶液，連續進樣5次，對各共有峰的相對保留時間(以葡萄糖的保留時間為參照)和相對峰面積(占總峰面積百分比)進行統計。結果表明，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積基本一致，RSD＜3%，表明靈芝孢子粉多糖的指紋圖譜精密度試驗符合要求。

2．1．4 方法重復性

分別準確稱取13號靈芝孢子粉樣品5份，按照上述提取、水解和衍生化方法平行處理樣品，并在同樣的上述色譜條件下進行HPLC分析，對各共有峰的相對保留時間(以葡萄糖的保留時間為參照)和相對峰面積(占總峰面積百分比)進行統計。結果表明，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，表明靈芝孢子粉多糖的指圖譜重現性試驗符合要求。

2． 2 靈芝孢子粉多糖的標準色譜指紋圖譜

取各供試品溶液50μL，注入高效液相色譜儀，記錄1h的色譜圖。以葡萄糖的峰為參照峰(S峰)，計算相對保留時間和相對峰面積，見表1。

表1 靈芝孢子粉多糖部分酸水解產物的PMP衍生物特征峰的相對保留時間和相對峰面積范圍

根據15批供試品溶液HPLC譜給出的相關參數，比較供試品譜圖，其中19個峰是各批供試品所共有的，因此確定19個峰為共有指紋峰，且共有峰總面積占總峰面積的95%以上。在共有指紋峰中，2號、15號(s峰)、16號和19號峰的峰面積大于總峰面積的5%(見表1)。各共有峰均按其相對保留時間定性，可知圖1中2號、7號、8號、10號、14號、15號、16號、17號、18號、19號峰分別為甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖，12號峰為二糖，3號、9號峰為三糖。

將色譜圖譜數據導入指紋圖譜專用軟件中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版(見圖2)。以批號為1的藥材的指紋圖譜作為參照譜圖，以中位數法生成15批藥材的對照用指紋圖譜，得到靈芝孢子粉多糖的標準色譜指紋圖譜，見圖3。

圖2 15個靈芝孢子粉多糖樣品的HPLC圖譜

圖3 靈芝孢子粉多糖樣品的HPLC標準指紋圖譜

2． 3 15個靈芝孢子粉多糖樣品色譜指紋圖譜的相似度評價結果

運用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版對15批靈芝孢子粉多糖的指紋圖譜進行分析，通過相似度評價結果可以發現，同一產地不同批次產品間的相似度較高，大于0．97;不同產地產品間的相似度較低，但仍然大于0．8。

2． 4 不同部位及不同品種靈芝多糖樣品與靈芝孢子粉標準指紋圖譜的比較

用同樣的方法對不同部位及不同品種靈芝多糖樣品進行分析后，得到它們的PMP-HPLC圖譜，見圖4。將它們與赤芝孢子粉多糖的標準指紋圖譜相比較，可以發現有顯著差別:赤芝子實體多糖圖譜4(a)中木糖和阿拉伯糖的相對峰面積均大于總峰面積的11%，而標準指紋圖譜中這2個峰的峰面積在0．5%～5%左右。紫芝孢子粉多糖圖譜4(b)中葡萄糖峰的相對峰面積大于總峰面積的65%，與靈芝孢子粉多糖的標準指紋圖譜顯著不同。紫芝子實體多糖圖譜4(c)與靈芝孢子粉多糖的標準指紋圖譜相比，共有特征峰個數明顯不足。這些結果表明，不同部位及不同品種的靈芝類產品的指紋圖譜特征會有較大的差異，這些差異可作為區別赤芝孢子粉與其他不同部位及不同品種的靈芝產品的主要依據之一。

圖4 不同部位及不同品種靈芝樣品的多糖PMP-HPLC圖譜

3 結論

首次利用部分水解耦合PMP/RP-HPLC的分析技術，從糖組成、特征水解片段的結構特性角度，對靈芝多糖進行檢測和表征，通過15個不同來源的有代表性的靈芝孢子粉樣品中多糖組分的指紋分析，構建了靈芝孢子粉多糖的HPLC指紋圖譜。此指紋分析方法穩定可靠，重復性好，可作為靈芝孢子粉質量標準的主要依據之一，應用于質量監控。

靈芝孢子粉樣品的相似度評價結果顯示:同一產地不同批次產品間的相似度較高，大于0．97;不同產地產品間的相似度較低，但仍然大于0．8。此特征可用于靈芝孢子粉的產地來源鑒別。

對靈芝孢子粉與其他不同部位和不同品種的靈芝類樣品中多糖組分的指紋分析及比較的結果表明，不同部位及不同品種的靈芝類產品的指紋圖譜特征呈現較大的差異，這些差異可用于赤芝孢子粉與其他不同部位及不同品種的靈芝產品的鑒別與摻混檢測。

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