鄰苯三酚紅-銅(Ⅱ)分光光度法測定牛奶中的蛋白質

馬占玲，顧佳麗，曾凌

(渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧錦州，121013)

目前有不少測定蛋白質的方法，如凱氏定氮法、分光度法［1－6］、熒光法［7］和新發展起來的共振瑞利光散射分析法［8－9］等。分光光度法因其簡便、快速、經濟和準確等特點而得到廣泛應用。其中應用最多的是考馬斯亮藍法。染料結合法也是一種簡便而常用的方法，目前文獻報道的染料有:曙紅［10］、茜素紅、四溴螢光黃二鈉鹽、鈣黃綠素［11］、偶氮胂(Ⅲ)-鑭(Ⅲ)［12］等。但這些方法均存在受雜質干擾嚴重，操作復雜，不穩定等缺點。本文研究了一種新的測定牛奶中蛋白質的光度分析法——鄰苯三酚紅-銅絡合物法，采用該方法測定牛奶中的蛋白質含量，獲得較理想的分析結果。

1 材料與方法

1.1 試劑

牛血清白蛋白(BSA)，上海麗珠東風生物技術有限公司;鄰苯三酚紅、CuSO4(均為分析純)。

1.2 儀器

756紫外-可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司。

1.3 實驗方法

在中性條件下，鄰苯三酚紅與銅絡合生成紫色絡合物，加入BSA或牛奶后顏色變深。分別測定增色前后吸光度值，然后求出吸光度差值ΔA。因為ΔA與蛋白質的濃度成正比，進而求出樣品中蛋白質的含量。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

牛血清白蛋白標準溶液在最佳條件下使鄰苯三酚紅銅的絡合體系增色，用去離子水做參比，對增色體系進行波長掃描，確定最大吸收波長，結果見圖1。

圖1 最大吸收波長掃描圖

從圖1看出，吸收曲線呈不規則拋物線形，在200～800 nm有2個吸收峰。本實驗選擇第2個吸收峰所對應的波長517 nm為測量波長。

2.2 最佳實驗條件的確定

2.2.1 鄰苯三酚紅最佳用量的確定

在固定其他顯色條件不變的前提下，只改變鄰苯三酚紅溶液的體積V鄰，測其吸光度。同時測定未加牛血清白蛋白工作液體系的吸光度，計算兩溶液的吸光度之差ΔA，結果見圖2。

圖2 鄰苯三酚紅用量對吸光度差值的影響

從圖2看出，鄰苯三酚紅的體積在0～2.00 mL，ΔA隨鄰苯三酚紅用量的增加而增大，鄰苯三酚紅溶液的體積在2.00 mL后吸度差值變化不大，因此選擇2.00 mL為鄰苯三酚紅溶液的最佳用量。

2.2.2 CuSO4溶液的用量

按實驗步驟操作，只改變CuSO4溶液的用量，考察它對吸光度之差ΔA的影響。在0.00～0.80 mL，ΔA隨CuSO4溶液體積的增加逐漸增大，在0.80 mL時達到最大值。當體積大于0.80 mL后，吸光度差值逐漸減小。因此選擇0.80 mL為CuSO4的最佳用量。即鄰苯三酚紅與Cu2+的最佳摩爾比是5∶2。

2.2.3 加熱溫度的確定

取2個50 mL容量瓶，加入14.00 mL鄰苯三酚紅－Cu2+混合溶液，一只容量瓶中加入5.00 mL牛血清白蛋白工作液，另一只容量瓶不加。在不同溫度下放置10 min，然后在517 nm處測量其吸光度之差ΔA。試驗發現，ΔA在10～30℃變化較小，30℃以后逐漸減小，因此選擇20℃為測量溫度。

2.2.4 反應時間的確定

按實驗操作步驟，顯色體系在室溫下靜置不同時間后立刻用紫外可見分光光度計在517 nm處測量其吸光度之差ΔA，考察時間對吸光度差值的影響，結果見圖3。

圖3 反應時間對△A的影響

由圖3可見，反應在5～50 min，ΔA隨時間的延長而變化不大，可見反應體系比較穩定。綜合考慮，選擇反應時間為10 min。

2.3.5 工作曲線的繪制

取6個 10 mL比色管，分別加入 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 牛血清白蛋白標準工作液和2.80 mL鄰苯三酚紅與CuSO4的混合溶液;在最佳實驗條件下進行顯色，測量。以牛血清白蛋白的濃度為橫坐標，ΔA為縱坐標，繪制工作曲線。得到工作曲線方程為 ΔA=0.01c－0.025 5，相關系數為0.990 3。

2.3.6 樣品測定

采用本方法對市售牛奶進行測量，同時采用國標法——乙酰丙酮，甲醛法進行對比試驗，結果見表1。

表1 樣品測定結果

由表1可見，采用鄰苯三酚紅－銅(Ⅱ)法測定牛奶中蛋白質的含量與國標法相比，誤差在1.8% ～2.8%，準確度較高，而且精密度較好，相對平均偏差在1.61%～2.58%。

2.3.7 回收率的測定

4個加標回收實驗測得結果見表2?；厥章试?3.1% ～108.5%，在光度允許誤差范圍之內。

表2 回收率的測定

3 結論

采用中性鄰苯三酚紅－銅(Ⅱ)絡合體系測定牛奶中蛋白質含量，方法準確度較高，精密度也較好，而且顯色體系比較穩定。采用該方法測定多種牛奶樣品中的蛋白質含量，與國標法比較，結果令人滿意。

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