雙波長(zhǎng)比例法測(cè)定單細(xì)胞活性氧探析

趙成瑞， 崔香麗， 吳博威 (山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院生理教研室， 汾陽(yáng) 0300;山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系;通訊作者，Tel:0358 －733，E-mail:zhaochengruizcr@63.com)

雙波長(zhǎng)比例法測(cè)定單細(xì)胞活性氧探析

趙成瑞1*， 崔香麗2， 吳博威2(1山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院生理教研室， 汾陽(yáng) 032200;2山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系;*通訊作者，Tel:0358 －7231312，E-mail:zhaochengruizcr@163.com)

目的 建立雙波長(zhǎng)比例法測(cè)定單細(xì)胞活性氧的方法。 方法 ①酶法急性分離成年大鼠心室肌細(xì)胞，用離子影像系統(tǒng)測(cè)定熒光信號(hào)，確定熒光強(qiáng)度值變化相反的兩個(gè)激發(fā)光波長(zhǎng)。②BPS-4裝置灌流心肌細(xì)胞，模擬心肌缺血/再灌注模型及再灌注時(shí)應(yīng)用還原型谷胱甘肽，用雙波長(zhǎng)比例法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧含量變化，驗(yàn)證此法。 結(jié)果 ①熒光強(qiáng)度值最大和最小的激發(fā)光波長(zhǎng)分別是:480 nm和420 nm，以F480/F420的比值表示活性氧的含量。②心室肌細(xì)胞在模擬缺血期和恢復(fù)再灌注期的相對(duì)F480/F420分別為缺血前的(115.27±4.52)%和(116.99±3.99)%，在再灌注期給予GSH，則活性氧含量降為缺血前的(101.14±3.20)%。 結(jié)論 雙波長(zhǎng)比例法可用于測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧。

活性氧; 缺血再灌注; 還原型谷胱甘肽

活性氧是化學(xué)性質(zhì)較活潑的含氧代謝物質(zhì)，反應(yīng)性強(qiáng)、壽命短，難檢測(cè)［1，2］，因此研究其檢測(cè)方法尤為重要。生物學(xué)、醫(yī)學(xué)最先研究活性氧的方法有脈沖射解、順磁共振和自旋搜集技術(shù)，利用化學(xué)熒光指示劑二氯二氫熒光素乙酸酯(2'，7'－dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為 480 nm左右，發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm，用測(cè)得的DCF熒光信號(hào)來(lái)間接反映活性氧含量，是一種單波長(zhǎng)法［3－6］。這些方法所需儀器昂貴，不適于普及，且所測(cè)結(jié)果受染料導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的濃度、細(xì)胞厚度、光褪色和染料漏出胞外等因素影響而不準(zhǔn)確，特建立雙波長(zhǎng)比例法，利用離子影像系統(tǒng)，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的活性氧。

1 材料與方法

1.1 試劑及主要儀器 膠原酶P、化學(xué)熒光染料DCFH-DA、二甲基亞砜、牛磺酸、L－谷氨酸、還原型谷胱甘肽、N－2－羥乙基哌嗪－N'－2－乙烷磺酸、乙二醇(2－氨基乙醚)四乙酸為Sigma公司產(chǎn)品;其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭ｋx子影像分析系統(tǒng)為德國(guó)Tillphotonics公司產(chǎn)品;BPS-4灌流裝置為美國(guó)Ala Scientific Instruments Inc公司產(chǎn)品;倒置熒光顯微鏡為德國(guó)Zeiss公司產(chǎn)品。

1.2 動(dòng)物來(lái)源 Wistar大鼠，體重280－300 g，雌雄不拘，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 確定熒光強(qiáng)度值變化相反的兩個(gè)波長(zhǎng) 酶法急性分離單個(gè)大鼠心室肌細(xì)胞。復(fù)鈣、負(fù)載染料DCFH-DA、選取結(jié)構(gòu)良好的細(xì)胞用10 mmol/L的雙氧水進(jìn)行灌流。設(shè)置激發(fā)光波長(zhǎng)從340 nm到580 nm，以20 nm波長(zhǎng)的間隔遞增，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行掃描，記錄熒光光譜曲線及每個(gè)波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度值，發(fā)射光波長(zhǎng)固定為510 nm，確定熒光強(qiáng)度值變化相反的兩個(gè)波長(zhǎng)。

1.3.2 心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的測(cè)定 酶法急性分離單個(gè)大鼠心室肌細(xì)胞。復(fù)鈣、負(fù)載染料DCFHDA、選取結(jié)構(gòu)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。設(shè)置激發(fā)光波長(zhǎng)分別為480 nm和420 nm，系統(tǒng)發(fā)射光的波長(zhǎng)定為510 nm。離子影像系統(tǒng)依次采集激發(fā)光為480 nm和420 nm的成對(duì)系列圖像，并從同一對(duì)系列圖像計(jì)算出的熒光比值F480/F420，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平以F480/F420表示。并計(jì)算出相對(duì)于正常(缺血前)的相對(duì)熒光密度，以表示細(xì)胞內(nèi)活性氧的變化，結(jié)果以相對(duì)熒光密度表示(100%)。

1.3.3 心肌細(xì)胞模擬缺血再灌注模型的建立 利用BPS-4裝置對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行灌流。在對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行灌流以前，盛有缺血臺(tái)式液的容器被封閉，并通過(guò)特制旁口持續(xù)充以100%的氮?dú)?0 min。心肌細(xì)胞模擬缺血:將心肌細(xì)胞置于特制灌流槽內(nèi)，用模擬缺血臺(tái)氏液，對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行灌流，并通過(guò)灌流槽特制側(cè)孔在灌流槽的上方持續(xù)充以100%氮?dú)猓诠嗔鞑凵戏街靡暂d玻片，使灌流槽形成一密閉腔。心肌細(xì)胞模擬再灌注:灌以正常臺(tái)氏液，停止充氮?dú)猓㈤_(kāi)放灌流槽。在實(shí)驗(yàn)中監(jiān)測(cè)灌流液氧分壓，以模擬缺血后氧分壓為55－60 mmHg為模型成功。

1.3.4 心肌細(xì)胞再灌注時(shí)抗氧化劑的應(yīng)用 心肌細(xì)胞模擬缺血后，利用BPS-4裝置對(duì)心肌細(xì)胞以含有0.8 mmol/L還原型谷胱甘肽(GSH)的臺(tái)氏液進(jìn)行灌流。

1.3.5 實(shí)驗(yàn)分組 心肌細(xì)胞被隨機(jī)分為3組:正常臺(tái)氏液灌注組(control group):心肌細(xì)胞給予30 min正常臺(tái)氏液灌注;模擬缺血/再灌注組(I/R group):心肌細(xì)胞先給予2 min正常臺(tái)氏液灌注，之后給予20 min模擬缺血和8 min模擬再灌注;抗氧化劑保護(hù)組(GSH group):心肌細(xì)胞先給予2 min正常臺(tái)氏液灌注，之后給予20 min模擬缺血和8 min的含GSH的臺(tái)氏液再灌注。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示。采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 通過(guò)對(duì)選取細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后記錄的熒光光譜曲線，以及每個(gè)激發(fā)光波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度值進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，熒光信號(hào)強(qiáng)度值變化相反的兩個(gè)激發(fā)光波長(zhǎng)分別是480 nm和420 nm，在480 nm時(shí)熒光信號(hào)強(qiáng)度值最大，在420 nm時(shí)熒光信號(hào)強(qiáng)度值最小(見(jiàn)圖1)，并且在實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞所得結(jié)果都一致和穩(wěn)定。所以確定這兩個(gè)波長(zhǎng)作為用雙波長(zhǎng)比例測(cè)量法測(cè)定單細(xì)胞活性氧的兩個(gè)激發(fā)光波長(zhǎng)，以F480/F420的形式表示細(xì)胞內(nèi)的活性氧。

圖1 各個(gè)激發(fā)光波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度值Fig 1 The fluorescence intensities at different excitation wavelengths

2.2 正常臺(tái)氏液灌注時(shí)，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度比值(F480/F420)相對(duì)穩(wěn)定(見(jiàn)圖2);模擬缺血后，細(xì)胞熒光強(qiáng)度比值迅速增加，在缺血末20 min時(shí)相對(duì)熒光密度為(115.27±4.52)%;再灌注后，心肌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度比值在2 min內(nèi)出現(xiàn)高峰，之后輕度降低維持在相對(duì)較高的水平，相對(duì)熒光密度為(116.99±3.99)%(見(jiàn)表1，圖3);若再灌注時(shí)加入 0.8 mmol/L還原型谷胱甘肽，細(xì)胞熒光強(qiáng)度比值迅速下降，相對(duì)熒光密度為(101.14 ±3.20)%(見(jiàn)表1，圖4)。

圖2 正常臺(tái)式液灌注組心肌細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度比值Fig 2 The fluorescence intensities of intracellular ROS in cardiomyocytes in control group

表1 模擬缺血再灌注與用GSH心肌細(xì)胞相對(duì)熒光密度比較(%)Tab 1 Comparison of relative fluorescene intensities of intracellular ROS in cardiomyocytesin I/R group and GSH group (%)

與 control組比較，△P ＜0.05;與 I/R 組比較，#P ＜0.05

圖3 模擬缺血再灌注組心肌細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度比值Fig 3 The fluorescence intensities of intracellular ROS in cardiomyocytes in I/R group

圖4 模擬缺血后用GSH組心肌細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度比值Fig 4 The fluorescence intensities of intracellular ROS in cardiomyocytes in GSH group

3 討論

利用離子影像系統(tǒng)建立雙波長(zhǎng)比例法測(cè)定心肌細(xì)胞內(nèi)的活性氧。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，激發(fā)光波長(zhǎng)為480 nm時(shí)，所得到的DCF熒光信號(hào)強(qiáng)度值最大，這與目前已知的用激光共聚焦掃描顯微鏡、流式細(xì)胞儀等儀器使用480 nm的激發(fā)光波長(zhǎng)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的活性氧相一致［7，8］。實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的420 nm的激發(fā)光波長(zhǎng)時(shí)所得的熒光信號(hào)強(qiáng)度值最小，所以確定這兩個(gè)激發(fā)光波長(zhǎng)，建立雙波長(zhǎng)比例測(cè)量法。模擬缺血再灌注模型，用此法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的變化，與已知的缺血再灌注發(fā)生中活性氧的變化情況進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證此法的可行性［9］。

雙波長(zhǎng)比例測(cè)量法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的活性氧，缺血期心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧含量升高，在再灌注剛開(kāi)始2 min內(nèi)，活性氧含量迅速升高，產(chǎn)生一個(gè)峰值，后下降，但是仍然保持較高水平，和缺血期間沒(méi)有明顯差異。再灌注時(shí)，加還原型谷胱甘肽后心肌細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量明顯下降至接近于正常水平，與電子自旋共振技術(shù)直接測(cè)定活性氧的結(jié)果是一致的［10］，說(shuō)明了這種方法可以用來(lái)檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)的活性氧。

雙波長(zhǎng)比例法具有以下明顯優(yōu)于單波長(zhǎng)法的優(yōu)點(diǎn):不受染料導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的濃度、細(xì)胞厚度、光褪色和染料漏出胞外等影響，所測(cè)結(jié)果以比值的形式來(lái)表示，消除了背景熒光強(qiáng)度的干擾，更加準(zhǔn)確。這是一種簡(jiǎn)便、易行的測(cè)定方法，建立后將有助于活性氧在有關(guān)研究領(lǐng)域的開(kāi)展。當(dāng)然這種方法還只是處于一種初步建立階段，更多的實(shí)驗(yàn)工作、檢測(cè)指標(biāo)正在進(jìn)一步的完成中。

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Double wavelengths ratio in detection of the concentrations of reactive oxygen species

ZHAO Cheng-rui1*，CUI Xiang-li2，WU Bo-wei2(1Dept of Physiology，F(xiàn)enyang College of Shanxi Medical University，F(xiàn)enyang 032200，China;2Dept of Physiology，Shanxi Medical University;*Corresponding author，Tel:0358－7231312，E-mail:zhaochengruizcr@163.com)

ObjectiveTo establish the double wavelengths ratio for detecting the concentrations of reactive oxygen species(ROS)in single cell.Methods①Adult rat cardiomyocytes were isolated by enzymatic dissociation.Fluorescence signals of the single cell were recorded by the ion imaging system for finding the two excitation wavelengths which made the biggest and the smallest fluorescence signal intensities.②Cardiomyocytes were perfused with BPS-4 to imitate the ischemia/reperfusion model.Some cardiomyocytes were reperfused with GSH.The intracellular ROS concentrations were measured.Results①The values of the fluorescence intensity at 480 nm and 420 nm were the biggest and smallest，respectively.F480/F420 was used to represent the intracellular ROS concentrations.②At mimic ischemia and reperfusion stages，intracellular ROS fluorescence intensities(F480/F420)increased progressively to(115.27 ±4.52)%and(116.99 ±3.99)%of pre-ischemia respectively.When GSH was used in reperfusion，ROS fluorescence intensity decreased quickly to(101.14 ±3.20)%of pre-ischemia.ConclusionDouble wavelengths ratio could be used to detect intracellular ROS.

reactive oxygen species;ischemia reperfusion;reduced glutathione

O657

A

1007 －6611(2011)01 －0007 －03

10.3969/J.ISSN.1007 －6611.2011.01.002

趙成瑞，女，1980－02生，碩士，助教，E-mail:zhaochengruizcr@163.com.

2010－11－01］