人參皂苷Rg1拮抗MPTP誘導(dǎo)小鼠黑質(zhì)中鐵增高的作用

楊海東， 林碧蓮 (莆田學(xué)院醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 莆田 3500;莆田學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院保健科)

人參皂苷Rg1拮抗MPTP誘導(dǎo)小鼠黑質(zhì)中鐵增高的作用

楊海東1， 林碧蓮2(1莆田學(xué)院醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 莆田 351100;2莆田學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院保健科)

目的 研究人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1，Rg1)對1－甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氫吡啶(1-methy-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)致帕金森病(Parkinson’s disease，PD)小鼠黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元變性的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。 方法 C57BL6小鼠隨機(jī)分為正常對照組(NS，i.p.)、MPTP組(30 mg/kg×5 d，i.p.)及 Rg1(5 mg/kg×8 d，i.p.)預(yù)處理組。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法、Perls’鐵染色、逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)以及圖像分析等技術(shù)觀察黑質(zhì)內(nèi)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(dopamine transporter，DAT)免疫反應(yīng)活性變化、鐵染色陽性細(xì)胞數(shù)的變化和DAT mRNA的表達(dá)水平的變化，用高效液相色譜法(HPLC)檢測小鼠紋狀體內(nèi)DA及其代謝物二羥基苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)和高香草酸(homovanillic acid，HVA)含量。 結(jié)果 與正常對照組相比，MPTP組黑質(zhì)內(nèi)鐵染色陽性細(xì)胞數(shù)增高以及紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC和HVA的含量明顯減少;與MPTP組相比，Rg1預(yù)處理組黑質(zhì)內(nèi)鐵染色陽性細(xì)胞數(shù)降低以及紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC和HVA的含量明顯增加(P＜0.01)。與正常對照組相比，MPTP組黑質(zhì)內(nèi)DAT免疫反應(yīng)活性和DAT mRNA的表達(dá)明顯降低(P＜0.01);與MPTP組相比，Rg1預(yù)處理組黑質(zhì)內(nèi)DAT免疫反應(yīng)活性和DAT mRNA的表達(dá)有所增高(P＜0.05)。 結(jié)論 Rg1對MPTP致PD小鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與Rg1能通過降低MPTP誘導(dǎo)的鐵過多聚積從而拮抗氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

帕金森病;1－甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氫吡啶; 人參皂苷Rg1; 多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白; 鐵

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)，是一種常見的中老年人中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾病，嚴(yán)重影響病人生存質(zhì)量，50歲以上人群發(fā)病率約1% －2%［1］。PD主要病理改變是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元進(jìn)行性變性、脫失及伴發(fā)黑質(zhì)(substantia nigra，SN)、紋狀體(striatum)軸突末梢DA耗竭，從而導(dǎo)致基底節(jié)神經(jīng)功能的紊亂［2］。早在1924年就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PD病人黑質(zhì)中鐵含量明顯高于正常人，隨著研究的進(jìn)展，人們逐漸認(rèn)識到鐵在PD的發(fā)病機(jī)制中起到關(guān)鍵的作用［3］。多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(dopamine transporter，DAT)是中樞DA能神經(jīng)元突觸前膜的一種膜蛋白，是突觸前膜再攝取釋放至突觸間隙DA的物質(zhì)基礎(chǔ)，是反映含DA神經(jīng)末梢部位活性的良好指標(biāo)［4］。

目前，PD的治療多采用DA的替代療法即服用DA的前體左旋多巴，來彌補(bǔ)腦內(nèi)DA不足，以改善臨床癥狀，但這并不能阻止DA能神經(jīng)元的繼續(xù)凋亡，而且DA本身也可誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡，左旋多巴的這些副作用也極大地限制了它的應(yīng)用。人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1，Rg1)是近年來研究較多的一種人參單體，藥理研究表明它具有抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡、抗衰老、抗氧化、提高免疫力和類雌激素等作用［5，6］。故實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步探討人參皂苷Rg1對黑質(zhì)內(nèi)DA的保護(hù)作用并探討其可能機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 健康雄性C57BL小鼠，10－12周，體重(21±2)g，雄性，36只，購自北京維通利華動物實(shí)驗(yàn)中心，動物合格證號:SCXK(京)2002－0003。

1.2 藥物與試劑 MPTP、DA、DOPAC、HVA、DAT抗體(Sigma公司)，人參皂苷Rg1(美國LKT Laboratories公司產(chǎn)品)，DAB試劑盒(北京中杉試劑公司)，Trizol試劑(GIBCO公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PROMEGA公司)，Tag DNA聚合酶、DNA Marker-DL2000(TAKARA公司)。

1.3 儀器 臺式低溫離心機(jī)(德國Eppendorf產(chǎn)品);DNA thermal cycler(Peltier公司);電泳儀(Amershan Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品);紫外凝膠成像系統(tǒng)及分析軟件(上海天能Tanon公司產(chǎn)品);冰凍切片機(jī)(德國Leitz公司制造);高效液相色譜儀(美國Waters公司產(chǎn)品)。

2 方法

2.1 分組與給藥 將小鼠隨機(jī)分為3組，每組12只，其中6只用于斷頭取腦紋狀體和黑質(zhì)活組織，6只用于腦灌注固定做腦切片。置于室溫(19±2)℃，12:12 h晝夜循環(huán)光照條件下生活，自由飲水、取食。動物于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境一周。MPTP模型組:每天上午10:00腹腔注射(i.p.)MPTP(30 mg/kg)，連續(xù)5 d;Rg1預(yù)處理組:每天上午8:00先行腹腔注射Rg1(5 mg/kg)，連續(xù)3 d，其后于上午8:00腹腔注射Rg1(5 mg/kg)及10:00腹腔注射MPTP(30 mg/kg)，連續(xù)5 d;正常對照組:腹腔注射等體積生理鹽水溶液。

2.2 免疫組織化學(xué)(IHC)測定 于末次注射24 h后用8%的水合氯醛腹腔注射麻醉，400 mg/kg，將小鼠深度麻醉后斷頭取腦固定，修整中腦組織塊進(jìn)行冠狀連續(xù)冰凍切片，參照試劑盒說明進(jìn)行DAT免疫組織化學(xué)染色。

2.3 鐵染色 上述切片同樣用于Fe3+的染色。切片在含有2%HCl與2%亞鐵氰化鉀等體積混合液(新鮮配置)30 min，PBS沖洗后浸泡在1%H2O2中去除內(nèi)源性過氧化物酶，在含有0.25 mg/ml DAB和0.02%(V/V)H2O2的PBS溶液中顯色10 min。

2.4 半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測腦內(nèi)DAT mRNA在黑質(zhì)中的表達(dá)

2.4.1 總RNA的提取 于末次注射24 h后將小鼠斷頭處死快速取出黑質(zhì)組織，加入Trizol試劑提取總RNA。

2.4.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(cDNA的合成) 利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求的標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系為 20 μl，42 ℃反應(yīng) 1 h，99 ℃加熱 5 min，然后快速冷卻到4℃以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶與cDNA結(jié)合，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用作PCR反應(yīng)模板，或暫放－20℃保存。

2.4.3 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR反應(yīng))PCR引物分別參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(見表1)。采用25 μl反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，DAT、GAPDH基因的擴(kuò)增參數(shù)為94℃預(yù)變性4 min，94℃變性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

表1 DAT、GAPDH基因的引物Tab 1 The primers of DAT，GAPDH genes

2.4.4 PCR產(chǎn)物定量分析 取擴(kuò)增產(chǎn)物于含溴化乙錠(ethidium bromide，EB)(0.5 μg/ml)的 2% 的瓊脂糖凝膠中電泳，80 V，25 min，運(yùn)用軟件對條帶進(jìn)行分析。每份樣本分別得到DAT和GAPDH基因的特異性擴(kuò)增條帶，用DAT與GAPDH比值表示DAT基因的表達(dá)水平。

2.5 高效液相色譜電化學(xué)檢測法(high performance liquid chromatography-electrochemical detection，HPLC-ECD)檢測紋狀體DA及其代謝產(chǎn)物

2.5.1 色譜柱條件 流動相:檸檬酸(H2O)4.202 8 g;乙酸鈉6.804 g;EDTA·2Na(2H2O)49.87 mg;八烷基磺酸鈉(H2O)(OSA)811.275 mg;二正丁胺(0.17 ml);甲醇 50 ml，用雙蒸水(ddH2O)稀釋至1 000 ml。最大柱壓 2 500 psi，流速 1.0 ml/min，ECD設(shè)定電壓0.65 V，每一樣品檢測35 min。

2.5.2 組織樣品的預(yù)處理 樣品轉(zhuǎn)入2.0 ml Eppendorf管中，準(zhǔn)確稱量，加入冰冷的樣品預(yù)處理A液 300 μl，冰浴中超聲 10 s(1 Hz，即振動 1 s，間歇 1 s，反復(fù)4－5次)，冰浴靜置 1 h，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，取240 μl上清液轉(zhuǎn)入另一 Eppendorf管中再加入120 μl冰冷的預(yù)處理B液，渦旋混勻，冰浴靜置1 h，4℃12 000 r/min離心20 min后置－80℃冷凍保存待測。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，應(yīng)用SPSS12.0軟件包進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)中Student-Newman-Keuls法檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 Rg1對MPTP PD模型小鼠DAT免疫反應(yīng)活性影響 MPTP模型組與正常對照組相比，黑質(zhì)內(nèi)DAT免疫反應(yīng)活性降低了53.8%(P＜0.01)，鐵染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多(P＜0.01);經(jīng)Rg1預(yù)處理后上述結(jié)果較模型組有所改善(P＜0.01)，但DAT免疫反應(yīng)活性仍低于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表2、圖1、圖2。

表2 Rg1對MPTP PD模型小鼠黑質(zhì)區(qū)DAT免疫反應(yīng)活性鐵染色陽性細(xì)胞數(shù)的影響(±s，n=6)Tab 2 Effect of Rgl on the DAT immunoreactive staining and iron staining in the substantia sigra of MPTP Parkinson disease mice(±s，n=6)

表2 Rg1對MPTP PD模型小鼠黑質(zhì)區(qū)DAT免疫反應(yīng)活性鐵染色陽性細(xì)胞數(shù)的影響(±s，n=6)Tab 2 Effect of Rgl on the DAT immunoreactive staining and iron staining in the substantia sigra of MPTP Parkinson disease mice(±s，n=6)

組別 DAT免疫反應(yīng)結(jié)合率%鐵染色陽性細(xì)胞數(shù)正常對照組2.47 ±0.07 12.04 ±1.35 MPTP 模型組 1.14 ±0.08* 33.18 ±2.56*Rg1 預(yù)處理組 1.93 ±0.07*# 17.54 ±2.09*#

與正常對照組相比，*P＜0.01;與MPTP模型組相比，#P＜0.01

圖1 小鼠黑質(zhì)內(nèi)DAT免疫組織化學(xué)染色(40×10)Fig 1 DAT expression in the substantia nigra of mice(40×10)

圖2 小鼠黑質(zhì)內(nèi)鐵免疫組織化學(xué)染色(40×10)Fig 2 Iron staining in the substantia nigra of mice(40×10)

3.2Rg1對MPTP PD模型小鼠 黑質(zhì)DAT mRNA表達(dá)的影響MPTP模型組與正常對照組相比DAT mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物明顯減少(0.469 ±0.228vs1.175 ±0.322，P＜0.05);經(jīng)Rg1預(yù)處理后DAT mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物(0.981±0.206)較 MPTP模型組有所增多(P＜0.05)。但經(jīng)Rg1預(yù)處理后與正常對照組相比仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，見圖3。

3.3 Rg1對MPTP PD模型小鼠紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物含量的影響 MPTP模型組DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC、HVA的含量與正常對照組相比分別下降了 72.51%，43.85%，65.89%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);Rg1預(yù)處理組DA、DOPAC和HVA的含量較MPTP模型組均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Rg1預(yù)處理組DA、DOPAC和HVA的含量仍低于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，見表 3)。

圖3 各組鼠黑質(zhì)內(nèi)DAT cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig 3 Amplified products of DAT cDNA in substantia sigra of mice by electrophoresis

表3Rg1對MPTP PD模型小鼠紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物含量的影響(ng/mg，±s，n=6)Tab 3Effect of Rgl on the contents of DA and its metabolites in the striatum of MPTP PD model mice(ng/mg，±s，n=6)

表3Rg1對MPTP PD模型小鼠紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物含量的影響(ng/mg，±s，n=6)Tab 3Effect of Rgl on the contents of DA and its metabolites in the striatum of MPTP PD model mice(ng/mg，±s，n=6)

與正常對照組相比，*P＜0.01;與MPTP模型組相比，#P＜0.05

組別DA DOPAC HVA正常對照組17.672 ±1.095 2.148 ±0.137 1.202 ±0.115 MPTP 模型組 4.857 ±0.549* 1.206 ±0.071* 0.410 ±0.048*Rg1 預(yù)處理組 12.025 ±1.161*# 1.638 ±0.403*# 0.911 ±0.086*#

4 討論

MPTP可導(dǎo)致黑質(zhì)－紋狀體系統(tǒng)內(nèi)DA能神經(jīng)元的損傷、線粒體能量耗竭和氧化應(yīng)激反應(yīng)等作用，并且它已作為一種可用于誘導(dǎo)制備PD模型并能模擬出人類PD癥狀的神經(jīng)毒性物質(zhì)有幾十年了［7，8］。兒茶酚胺降解酶、單胺氧化酶B可將MPTP轉(zhuǎn)變成有毒性的代謝產(chǎn)物MPP+。DA能神經(jīng)元末梢可通過細(xì)胞膜上的DAT特異性攝取MPP+，因此MPTP的毒性作用不僅作用于紋狀體，而且還可以作用于黑質(zhì)。MPP+可通過在線粒體內(nèi)膜堆積從而抑制復(fù)合物NADH脫氫酶的活性，干擾氧化磷酸化作用，阻斷了電子傳遞而減少ATP的合成導(dǎo)致ATP不足，從而導(dǎo)致DA能神經(jīng)元損傷。

DA的代謝不僅可通過神經(jīng)末梢突觸前膜的DAT作用被重?cái)z取至囊泡中貯存，還可通過兒茶酚胺氧位甲基轉(zhuǎn)移酶和單胺氧化酶B被代謝成為DOPAC和HVA。正常生理情況下，突觸間隙DA功能的消失主要是通過前者實(shí)現(xiàn)的。DAT是位于中樞DA神經(jīng)元突觸前膜的一種膜蛋白，屬于Na+、Cl－依賴性膜轉(zhuǎn)運(yùn)體基因家族，是調(diào)節(jié)和維持DA神經(jīng)遞質(zhì)的重要因子，它的功能活動、密度變化反映了DA遞質(zhì)系統(tǒng)功能［9］。近年來的研究表明，早期PD患者的DAT水平明顯降低，臨床研究也顯示DAT的改變與PD的嚴(yán)重程度有著良好的相關(guān)性，早期PD病人的基底節(jié)區(qū)DAT就較正常下降了31%－65%;研究還表明，DAT合成并表達(dá)于DA能神經(jīng)元胞體、樹突、軸突，然后被運(yùn)輸?shù)綐渫荒ぁ⑤S突膜上，因而中腦黑質(zhì)區(qū)具有較高的DAT mRNA轉(zhuǎn)錄［10］。本實(shí)驗(yàn)也觀察到MPTP可造成小鼠黑質(zhì)內(nèi)DAT免疫反應(yīng)活性下降了53.8%以及DAT mRNA的表達(dá)下降，與上述結(jié)果相符。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，MPTP可導(dǎo)致小鼠紋狀體中DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC、HVA 的含量分別下降 72.51%，43.85%，65.89%。應(yīng)用Rg1處理后上述指標(biāo)有所改善，說明Rg1對DA神經(jīng)元具有保護(hù)作用。

在體內(nèi)鐵是一種重要的微量金屬元素，它在氧的轉(zhuǎn)運(yùn)、電子傳遞和DNA合成等生物學(xué)功能中起著重要的作用。實(shí)驗(yàn)研究表明在黑質(zhì)內(nèi)，DA由單胺氧化酶B誘發(fā)的氧化脫胺及自身氧化生成黑色素的過程中都能產(chǎn)生H2O2。由Fe3+還原生成的Fe2+可與H2O2反應(yīng)，再通過Fenton反應(yīng)，H2O2+Fe2+→OH·+OH－+Fe3+，生成具有高度細(xì)胞毒作用的OH·，從而造成線粒體和其他細(xì)胞成分的損傷導(dǎo)致DA能神經(jīng)元的死亡［11］。黑質(zhì)內(nèi)鐵的增多可破壞機(jī)體內(nèi)氧化機(jī)制與抗氧化機(jī)制之間的平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生，引起細(xì)胞損傷;同時(shí)在線粒體呼吸鏈中，氧接受一個(gè)電子形成超氧陰離子O2·，O2·在過氧化物歧化酶的作用下可生成H2O2，而O2˙本身可促進(jìn)Fe3+由其鐵結(jié)合蛋白上的釋放，從而加速了OH·的生成，進(jìn)一步造成DA能神經(jīng)元死亡。有相關(guān)報(bào)道表明MPTP可以通過氧化應(yīng)激反應(yīng)而發(fā)揮神經(jīng)毒性作用，這可能與MPTP增高鐵積聚密切相關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)Fe2+可以使MPTP轉(zhuǎn)化成MPP+，結(jié)果使Fe3+增高，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)并與細(xì)胞毒性氧自由基相互作用而導(dǎo)致DA能神經(jīng)元的損傷［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MPTP可導(dǎo)致小鼠黑質(zhì)內(nèi)鐵染色陽性細(xì)胞數(shù)增高，這與本室前期研究結(jié)果相符［3，13］，說明 MPTP 可以通過增高鐵積聚導(dǎo)致氧化應(yīng)激從而促使DA能神經(jīng)元變性死亡。

本研究應(yīng)用Rg1處理后觀察到小鼠紋狀體內(nèi)DA及代謝物含量、黑質(zhì)內(nèi)DAT免疫反應(yīng)活性和DAT mRNA表達(dá)水平均比MPTP組明顯升高，黑質(zhì)內(nèi)鐵染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯少于MPTP組;我們推測Rg1可能是通過降低MPTP誘導(dǎo)的鐵過多聚積從而拮抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，起到保護(hù)黑質(zhì)DA神經(jīng)元的作用。

總之，MPTP可導(dǎo)致黑質(zhì)DA能神經(jīng)元變性、壞死，Rg1對MPTP致黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與Rg1抗氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

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The role of ginsenoside Rg1 in antagonism of MPTP-induced iron accumulation in substantia nigra of mice

YANG Hai-dong1，LIN Bi-lian2(1Dept of Physiology，Medical College of Putian University，Putian 351100，China;2Dept of Health Care，The Affiliated Hospital of Medical College of Putian University)

ObjectiveTo investigate the effect of ginsenoside Rg1 on the degeneration of dopaminergic neurons in the substantia nigra in 1-methy-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine(MPTP)treated C57BL6 mice.MethodsMice were randomly divided into three groups:normal group，MPTP group and Rg1 pretreatment group.The mice were injected intraperitoneally with normal saline in normal group，30 mg/kg MPTP for 5 d in MPTP group，and 5 mg/kg Rg1 for 8 d and 30 mg/kg MPTP for 5 d in Rg1 pretreatment group，respectively.RT-PCR，immunohistochemistry，Perls’iron staining were used to observe the immunoreactive staining of dopamine transporter(DAT)protein，iron-positive cells and expression of DAT mRNA in the substantia nigra，respectively.HPLC was used to detect the contents of dopamine and its metabolites，dihydroxyphenylacetic acid and homovanillic acid in striatum of mice.ResultsThe DAT immunoreactive staining and expression of DAT mRNA in the substantia nigra，and the contents of dopamine and its metabolites in the striatum were significantly lower in MPTP group than in control group(P＜0.01)，while iron staining was significantly higher(P＜0.01).Compared with MPTP group，the DAT immunoreactive staining and expression of DAT mRNA in the substantia nigra，and the contents of dopamine and its metabolites in the striatum increased significantly(P＜0.05 orP＜0.01)，while iron staining significantly decreased(P＜0.01).ConclusionGinsenoside Rg1 could protect against the MPTP-induced neurotoxicity of dopaminergic neurons in PD mice by decreasing the MPTP-induced iron accumulation for inhibiting the oxidative stress reaction.

Parkinson’s disease;1-methy-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine(MPTP);ginsenoside Rg1;dopamine transporter;iron

R741.02

A

1007 －6611(2011)01 －0010 －05

10.3969/J.ISSN.1007 －6611.2011.01.003

莆田市科技計(jì)劃項(xiàng)目基金資助項(xiàng)目(2009S02(3))

楊海東，男，1976－02生，碩士，講師，E-mail:yhdzlx999890@163.com.

2010－11－11］