宮頸癌放療抗拒與缺氧誘導血管新生的關系

戴鈺輝， 張鵬程 (河北北方學院附屬第一醫院放射科， 張家口 075000;河北北方學院附屬第一醫院普外科)

宮頸癌放療抗拒與缺氧誘導血管新生的關系

戴鈺輝1， 張鵬程2(1河北北方學院附屬第一醫院放射科， 張家口 075000;2河北北方學院附屬第一醫院普外科)

目的 研究宮頸癌放療后抗拒與腫瘤缺氧誘導血管新生的關系及意義。 方法 選擇91例Ⅱb-Ⅳ期不同組織分級的宮頸癌放療患者。標本采集后用10%甲醛固定，常規石蠟包埋，4 μm連續切片，應用免疫組化方法檢測了91例宮頸癌組織中HIF-1α、COX-2、VEGF的陽性表達，同時標記CD105腫瘤新生血管，計算MVD。統計學處理應用SPSS16.0統計軟件進行分析，結果采用卡方檢驗、方差分析進行統計學分析，HIF-1α、COX-2、VEGF及CD105相關性用Spearman等級相關分析。 結果 隨著組織分化程度降低，腫瘤的放療抗拒增大。HIF-1α、COX-2、VEGF在高分化、中分化、低分化宮頸癌中的陽性表達逐漸升高，HIF-1α、VEGF與MVD之間存在正相關，且隨組織分級的降低，MVD的計數逐漸增加，差異有統計學意義(P＜0.05)。結論 腫瘤缺氧環境誘導多個因子表達升高，促進腫瘤血管新生，新生的腫瘤血管與不同組織分級的宮頸癌產生放療抗拒呈正相關，產生放療抗拒的大小也不同。

HIF-1α;COX-2;VEGF; 腫瘤血管新生; 放療抗拒

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤之一，放射治療是宮頸癌臨床治療的主要手段［1］。宮頸癌放療后產生抗拒，直接影響到治療的療效，但放射治療產生抗拒的機制不清楚。腫瘤血管新生為腫瘤提供氧和養分，使腫瘤生長、繁殖甚至更具侵襲性［2］，推測可能與腫瘤對放療抗拒有關。低氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)、COX-2、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)陽性表達與腫瘤缺氧和血管新生相關，本實驗通過檢測三種因子在不同組織分級的宮頸癌的陽性表達，并計數微血管密度(MVD)，以期為宮頸癌放射治療后的轉歸提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 從2007－10～2009－10在河北北方學院附屬第一醫收治的宮頸癌病例中選擇91例術前未經過放療、化療的宮頸癌術后腫瘤組織石蠟標本，具有完整的臨床病理資料。年齡26－68歲，平均年齡46歲。病理分級:高分化鱗癌18例、中分化鱗癌36例、低分化鱗癌37例。

1.2 試劑及來源 兔抗人HIF-1α、VEGF多克隆抗體、鼠抗人COX-2單克隆抗體、抗CD105單抗體，SP法試劑盒，MVD計數法。

1.3 實驗方法 患者均采用直線加速器外照射全盆腔，總量DT 50 Gy/25次/5周(DT 30－35 Gy時中線遮擋4 cm);3周時，高劑量率內照射(銥－192)，DT 5－7 Gy/次，每周一次，5－7周。A 點劑量:內照射2/3、外照射1/3;B點劑量內照射1/3，外照射2/3。放射治療前，均經宮頸取材SP法免疫組化，醫師閱片、核實、診斷。

1.4 判定標準 光鏡下觀察，HIF-1α和VEGF表達陽性為細胞質染色呈棕黃色顆粒，COX-2陽性染色表現在腫瘤細胞的胞膜、胞質內，呈彌漫性均勻棕黃色顆粒。根據陽性細胞所占比例及著色強度綜合制定免疫組化半定量記分標準為:①陽性細胞記分:＜1%，0分;1% －10%，1分;11% －50%，2分;51% －80%，3分;＞80%，4分。②著色強度記分:弱，1分;中，2分;強，3分。兩個分值相加為最終判定結果:1分(－);2－3分(+);4－5分(++);6－7分(+++)。0－3分為低表達，視為陰性;4－7分為高表達，視為陽性。

根據1979年WHO(World Health Organization)實體瘤近期客觀療效標準測量病變，完全緩解、部分緩解評定為放療敏感，無變化、惡化評定為放療抗拒。

1.5 微血管計數判定標準 任何被CD105抗體染成棕黃色孤立的內皮細胞或內皮細胞簇團，只要與鄰近微血管、腫瘤細胞或其他結締組織分開，就將其作為一個微血管，只要結構不相連，其分支結構也視為一血管。微血管密度(MVD)記數參照Weidner［3］報道的方法，以±s表示。

1.6 統計學分析 所有數據應用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據用±s進行描述，采用卡方檢驗、方差分析進行分析，HIF-1α、VEGF、COX-2 及CD105相關性用Spearman等級相關分析。P＜0.05被認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 放療抗拒 結果顯示，在不同組織分級的宮頸癌中均存在放療抗拒。而且隨著組織分化程度降低，腫瘤的放療抗拒增大(見表1)。

2.2 HIF-1α蛋白的表達 HIF-1α表達主要定位于細胞質，著色呈棕黃色。37例低分化鱗癌有26例呈陽性表達，陽性率70.1%，36例中分化鱗癌有20例呈陽性表達，陽性率55.6%。18例高分化鱗癌變有8例呈陽性表達，陽性率44.4%，表明HIF-1α的表達在低分化鱗癌與中分化鱗癌比較有統計學差異(P＜0.05);低分化鱗癌與高分化鱗癌比較有統計學差異(P＜0.05);中分化鱗癌與高分化鱗癌比較有統計學差異(P＜0.05，見表1)。

表1 HIF-1α、VEGF與COX-2在不同組織分級的宮頸癌中的表達與療效的關系Tab 1 Relationship between the expression of HIF-1α，VEGF，COX-2 in different histological grading of cervical cancer and curative effect

2.3 VEGF蛋白的表達 在腫瘤組織中，VEGF陽性表達主要定位于腫瘤組織的細胞質和細胞膜上，呈棕色或棕黃色。VEGF在低分化鱗癌、中分化鱗癌、高分化鱗癌組織陽性表達率分別是86.4%(32/37)，75.0%(27/36)，61.1%(11/18)，VEGF 在低分化鱗癌、中分化鱗癌、高分化鱗癌的表達兩兩比較差異均有統計學意義(P＜0.05，見表1)。

2.4 COX-2蛋白的表達 COX-2陽性染色表現在腫瘤細胞的胞膜、胞質內，呈彌漫性均勻棕黃色顆粒。COX-2在低分化鱗癌、中分化鱗癌、高分化鱗癌組織陽性表達率分別是 40.5%(15/37)，30.6%(11/36)，16.7%(3/18)，而且 COX-2 在低分化鱗癌、中分化鱗癌、高分化鱗癌的表達兩兩比較差異均有統計學意義(P＜0.05，見表1)。

在宮頸癌各病理分級組間HIF-1α、VEGF、COX-2表達的差異均有統計學意義(P＜0.05)。表2－4結果顯示，宮頸癌中HIF-1α、VEGF、COX-2相互間表達水平呈正相關，但HIF-1α與COX-2不完全一致。

表2 宮頸癌中HIF-1α與VEGF表達的關系Tab 2 Relation between the expression of HIF-1α and VEGF in cervical cancer

表3 宮頸癌中HIF-1α與COX-2表達的關系Tab 3 Relation between the expression of HIF-1α and COX-2 in cervical cancer

表4 宮頸癌中VEGF與COX-2表達的關系Tab 4 Relation between the expression of VEGF and COX-2 in cervical cancer

2.5 CD105的表達 CD105的染色定位于血管內皮細胞膜上呈棕黃色，分布于腫瘤及間質。微血管的形態不規則，有的新生血管區呈管腔結構，有的只是內皮細胞呈線狀或點狀分布。91例宮頸癌組織中，MVD計數平均46.7±9.2;MVD計數在低分化鱗癌、中分化鱗癌、高分化鱗癌分別是63.29±7.64，53.31 ±7.13，42.03 ±7.65，三組間比較有統計學差異(P＜0.05，見表5)，說明 MVD與宮頸癌的發生、發展密切相關。

2.6 三種因子在不同組織分級宮頸癌中的陽性表達與MVD的關系 結果顯示，HIF-1α伴隨組織分級的降低而升高，MVD的計數也逐漸增加，見表5，不同分級MVD的計數差異有統計學意義(P＜0.05)。VEGF伴隨組織分級的降低而升高，MVD的計數也隨之增加，不同分級MVD的計數具有統計學差異(P＜0.05，見表 5)。HIF-1α、VEGF 陽性表達與MVD計數呈正相關。COX-2伴隨組織分級的降低而升高，而不同分級MVD的計數不具有統計學差異(P＞0.05)。

表5 HIF-1α、VEGF、COX-2在不同組織分級宮頸癌中的陽性表達與MVD的關系Tab 5 Relation between the positive expression of HIF-1α，VEGF，COX-2 in different hidtological grading of cervical cancer and MVD

2.7 不同組織分級中HIF-1α表達與VEGF的表達、COX-2表達、MVD計數的相關性 Spearman直線相關分析顯示:HIF-1α表達與VEGF和COX-2的表達呈正相關關系(r分別為 0.776，0.525，均P＜0.05)，HIF-1α表達與MVD計數也呈正相關關系(r=0.671，P＜0.05)。VEGF 的表達與 MVD 計數呈正相關關系(r=0.647，P＜0.05)。

3 討論

宮頸癌應用放射治療越來越多，這是因為放射治療的安全性及在提高病人的生存質量方面明顯優于其他治療手段。腫瘤組織分化程度的不同，經常作為我們臨床醫師預估宮頸癌放療療效的參考，但并沒有科學的數據來準確判定。迄今為止，腫瘤血管新生對腫瘤生長、繁殖、侵襲的研究成為熱點。但腫瘤血管新生與放療抗拒的大小，放射治療對腫瘤血管新生的影響仍不明確。本研究通過對不同組織分級的宮頸癌患者進行分析和比對，了解不同組織分級的實體腫瘤缺氧誘導血管新生與放療抗拒的關系。

缺氧誘導腫瘤血管新生的機制非常復雜，可以激活多個信號通路，促進腫瘤血管的新生。本研究選擇關鍵因子HIF-1α、COX-2、VEGF來研究與腫瘤血管生成的關系，以此來判定腫瘤對放療抗拒的大小。

實體腫瘤本身不均勻血管新生的特性［1］，導致腫瘤的生長不均衡，腫塊內部缺氧程度也不同。放射治療本身對腫瘤富氧區非常敏化，這樣可以把腫瘤富氧細胞殺死，使腫瘤變小。而腫瘤的缺氧細胞再加之實體瘤本身存在缺氧區，其都對放療存在抗拒，不同組織分級的腫瘤新生血管的能力不同，導致不同組織分級的宮頸癌放射治療存在差異。已有研究表明腫瘤再生根本原因是這三種因子的陽性表達所致［4］。腫瘤細胞缺氧區可以促進HIF-1α因子的表達升高，HIF-1α是調節細胞內氧代謝的關鍵因子之一，其中HIF-1α為HIF-1所特有并受缺氧調控，其表達隨細胞內氧濃度的下降而增加。由于腫瘤缺氧環境又可使抑癌基因突變，促進了腫瘤HIF-1α過量產生，增加了腫瘤細胞在缺氧條件下的存活［5］。COX使花生四烯酸轉化為前列腺素酶，COX-2是誘生型異構體，在腫瘤血管生成中起重要作用［6］。其可促進血管生長因子釋放，增強其功能，促進VEGF表達上調［7］。表皮生長因子(VEGF)是已知最重要的血管生長因子［8、9］，VEGF 表達主要受缺氧環境的調節。VEGF通過與內皮細胞膜上的受體結合而發揮其內皮相關功能，調節內皮增殖，血管生成，調節血管通透性及血栓形成。不僅促進內皮細胞移動，有利于血管生成，還有利于腫瘤細胞脫落，進入血液或向臨近組織擴散，為腫瘤的浸潤、轉移創造條件。這三種因子相互作用，共同來促進腫瘤血管的新生，為腫瘤的再生長提供新的養分。在本研究的數據分析中，表明了不同組織分級的子宮頸癌，伴隨組織分化程度的降低，HIF-1α蛋白、COX-2和VEGF陽性表達升高。伴隨著三種因子的表達升高，腫瘤新生血管的能力增強。實性腫瘤的生長是血管依賴性的，腫瘤新生血管為腫瘤提供營養和轉移的途徑。

微血管密度(MVD)是衡量血管生成的定量指標。我們發現HIF-1α、VEGF的陽性表達隨組織分級的降低與MVD升高而升高，呈正相關。也說明了HIF-1α、VEGF有促進血管形成作用，HIF-1α的升高伴隨 COX-2、VEGF也升高，HIF-1α通過促進VEGF途徑調節腫瘤血管生成。實體瘤的缺氧環境促進HIF-1α、COX-2、VEGF的表達增強，腫瘤血管新生，為腫瘤再生長提供能量，導致放療的療效降低。也表明腫瘤組織分級越低，腫瘤對放射治療的抗拒增加越明顯。

總之，研究表明，腫瘤的放療抗拒，是因為HIF-1α、COX-2、VEGF這三種因子的通路鏈被激活，促進MVD形成新生血管，對實體瘤缺氧細胞再氧合起著關鍵作用，為腫瘤重新具有活力提供必要的氧和養分，導致腫瘤的放射治療療效不可預知。所以對任何使 HIF-1α、COX-2、VEGF、MVD 通路鏈斷裂或者抑制的治療，都能預判放療的療效。這樣為宮頸癌選擇常規分割治療或者超分割治療提供參考。

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Relationship between radiotherapy resistance and hypoxia-induced angiogenesis in cervical cancer

DAI Yu-hui1，ZHANG Peng-cheng2(1Dept of Radiology，First Affiliated Hospital of Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China;2Dept of Surgery，First Affiliated Hospital of Hebei North University)

ObjectiveTo explore the relationship between radiotherapy resistance and hypoxia-induced angiogenesis in cervical cancer.MethodsA total of 91 patients with stage Ⅱb-Ⅳcervical cancer treated with radiotherapy were enrolled in this study.The samples were fixed by 10%formaldehyde，embedded by general paraffin and sliced up continuously by 4 μm.The positive expression of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α)，vascular endothelial growth factor(VEGF)，COX-2 of cervical cancer tissue in 91 cases were measured by SP immunohistochemistry，and tumor angiogenesis was marked by CD105，and then microvessel density(MVD)was measured.SPSS16.0 software of statistics was used，and the data was analyzed by χ2test and analysis of variance.The relativity among HIF-1α，COX-2，VEGF and CD105 was analyzed by Spearman rank correlation analysis.ResultsThe radiotherapy resistance increased while the histological differentiation degree of cervical cancer decreased.The positive expression of HIF-1α，COX-2 and VEGF in the high，middle and low differentiated tissues of cervical cancer increased gradually.There was a positive correlation between HIF-1α，VEGF and MVD.The count of MVD increased with the decrease of histological differentiation degree，and the difference had statistical significance(P＜0.05).ConclusionThe tumor hypoxia could induce the increase of positive expression of many factors for accelerating the tumor angiogenesis.The angiogenesis is positively correlated the radiotherapy resistance in different histological grading of cervical cancer，and the degree of radiotherapy resistance is also different.

hypoxia-inducible factor-1α;COX-2;vascular endothelial growth factor;tumor angiogenesis;radiotherapy resistance

R730.2

A

1007 －6611(2011)01 －0042 －04

10.3969/J.ISSN.1007 －6611.2011.01.011

張家口市2010年科學技術研究與發展指導計劃項目(1021080D)

戴鈺輝，男，1973－10生，本科，主治醫師，E-mail:daiyan159582@163.com.

2010－08－30］