宮頸腺癌中HPV16/18與P16的表達及其相關性

張 玲， 劉 峰， 王全紅 (山西醫科大學病理教研室， 太原 0000;山西醫科大學法醫學院;山西省腫瘤醫院病理科)

宮頸腺癌中HPV16/18與P16的表達及其相關性

張 玲1， 劉 峰2， 王全紅3(1山西醫科大學病理教研室， 太原 030001;2山西醫科大學法醫學院;3山西省腫瘤醫院病理科)

目的 探討各類型宮頸腺癌與HPV16/18感染的關系，分析HPV16/18的感染率與P16表達之間的相關性。 方法應用原位雜交及免疫組織化學EnvisionTM二步法檢測31例宮頸管型腺癌，12例宮頸子宮內膜樣腺癌，9例宮頸微偏腺癌中

HPV16/18及P16的表達情況，另選36例宮頸鱗癌作對照。 結果 ①微偏腺癌中HPV16/18的檢出率低于其他各組，差異均具有統計學意義(P＜0.05);宮頸管型腺癌、子宮內膜樣腺癌中HPV16/18的檢出率與鱗癌相比差異無統計學意義(P＞0.05)。②微偏腺癌中P16蛋白的陽性表達率低于其他各組，差異均具有統計學意義(P＜0.05)。③所有HPV陽性患者P16的表達明顯高于所有HPV陰性患者，P16的陽性表達率與HPV16/18感染呈正相關(P＜0.05)。 結論 ①宮頸管型腺癌及宮頸子宮內膜樣腺癌與HPV16/18感染相關，而宮頸微偏腺癌可能與HPV16/18的感染無關。②P16蛋白的過表達可能參與了部分普通型宮頸腺癌的發生、發展，但在微偏腺癌中可能不起重要作用。③P16蛋白的高表達與HPV感染密切相關。

宮頸腺癌; 微偏腺癌;HPV16/18;P16

宮頸腺癌較鱗癌少見，大約占宮頸腫瘤的10%－30%，近幾年來宮頸腺癌的發病率逐漸上升［1，2］。人乳頭瘤狀病毒(HPV)與宮頸鱗癌發生的密切關系已經得到肯定。一些研究也揭示在宮頸腺癌中HPV的感染率較高［3］。宮頸微偏腺癌是一種罕見的高分化腺癌，僅占宮頸腺癌的1%－3%，因為其臨床表現缺乏特異性，細胞學異型性輕微，病理診斷非常困難，常易誤診和漏診。1870年Gusserow首次將此瘤稱之為惡性腺瘤(malignant adenocarcino ma)［4］，1975 年 Hurt等［5］認為其病理形態是稍偏離正常宮頸腺體的一種癌，是高度分化的腺癌，建議采用低離正性腺癌或微小偏離性腺癌(minimal deviation adenocarcinoma，MDA)一詞代替惡性腺瘤。

宮頸MDA比較罕見，因此對其HPV的檢測及相關性的研究很少，本研究通過原位雜交及免疫組化檢測了各類型宮頸腺癌(包括9例微偏腺癌)中HPV16/18及P16的表達，從而探討HPV16/18與各類型宮頸腺癌尤其是微偏腺癌發生的關系，并分析HPV16/18感染與P16表達的關系。

1 材料與方法

1.1 宮頸組織標本 研究標本取自山西省腫瘤醫院病理科1996－08～2008－03間住院手術病例共88例，包括宮頸微偏腺癌9例，宮頸管型腺癌31例，宮頸子宮內膜樣腺癌12例，宮頸鱗癌36例。

1.2 原位雜交 HPV16/18原位雜交試劑盒為美國ZYMED公司產品(購自北京中杉生物技術有限公司)，雜交方法為:切片常規脫蠟;100%乙醇浸泡5 min后空氣干燥;胃蛋白酶37℃孵育30 min;逐級酒精脫水后空氣干燥;每張切片加30 μl探針，蓋上蓋玻片;95℃變性5 min;37℃雜交過夜;PBS緩沖液中浸泡10 min，去掉蓋玻片，每張切片中加入5－6滴雜交洗液，37℃孵育15 min;加入50 μl辣根過氧化物酶標記抗地高辛抗體37℃孵育30 min;DAB顯色;復染;脫水;透明;封片。

1.3 免疫組化 P16的檢測采用免疫組化EnvisionTM二步法，鼠抗人單克隆抗體P16(ZM-0205)及二步法試劑盒均購自北京中杉生物技術有限公司。染色步驟參照試劑盒說明書進行。

1.4 結果判定 HPV16/18原位雜交結果判定:細胞核內出現棕黃色顆粒為HPV16/18陽性。免疫組織化學結果判定標準如下:隨機觀察10個高倍鏡視野，每個視野計數100個細胞，取平均染色陽性細胞數，計算陽性細胞百分率，≤20%為P16缺失或低表達，＞20%為陽性。

1.5 統計學分析 應用SAS8.0統計軟件進行分析，采用Fisher確切概率及χ2檢驗。

2結果

2.1 HPV16/18在各類型宮頸腺癌及鱗癌中的表達 HPV16/18 DNA主要存在于細胞核內，呈棕黃色顆粒。HPV16/18 DNA在9例宮頸微偏腺癌中有1例HPV16陽性(占11.11%);在31例宮頸管型腺癌中有21例陽性(占67.74%);在12例子宮內膜樣腺癌中有6例陽性(占50%);在36例宮頸鱗癌標本中有30例陽性(占83.33%);HPV16/18 DNA在宮頸微偏腺癌中的陽性表達率低于其他各組，差異均具有統計學意義(P＜0.05，見表1);宮頸管型腺癌、子宮內膜樣腺癌中HPV16/18的檢出率與鱗癌相比差異無統計學意義(P＞0.05)。

在21例HPV陽性的宮頸管型腺癌中HPV16陽性13 例(61.9%)，HPV18 陽性10 例(47.62%)，雙重感染2例(9.52%)，見表2;在6例HPV陽性的子宮內膜樣腺癌中 HPV16陽性3例(50%)，HPV18陽性4例(66.67%)，雙重感染1 例(16.67%);在30例HPV陽性的宮頸鱗癌中HPV16陽性23例(76.67%)，HPV18 陽性11 例(36.67%)，雙重感染4 例(13.33%)，見表 2。

表1 各類型宮頸癌組織中HPV16/18、P16的表達 例(%)Tab 1 Expression of HPV16/18 and P16 in different types of cervical adenocarcinoma cases(%)

表2 各類型宮頸癌組織中HPV感染類型 例(%)Tab 2 The types of HPV infection in different types of cervical adenocarcinoma cases(%)

2.2 P16在宮頸微偏腺癌、宮頸管型腺癌、子宮內膜樣腺癌及宮頸鱗癌中的表達 P16蛋白的陽性表達主要位于細胞質，部分細胞核也可見著色。P16蛋白在宮頸微偏腺癌、宮頸管型腺癌、子宮內膜樣腺癌及宮頸鱗癌中的陽性表達率分別為11.11%(1/9)、74.19%(23/31)、58.33%(7/12)、86.11%(31/36)。P16蛋白在宮頸微偏腺癌中的陽性表達率低于其他各組，差異均具有統計學意義(P＜0.05，見表1)。

2.3 各類型宮頸癌組織中HPV16/18感染與P16表達的相關性 在58例HPV感染的陽性病例中P16陽性51例(87.93%)，而在30例HPV感染的陰性病例中P16陽性11例(36.67%)，前者明顯高于后者(P＜0.05，見表3)。且P16蛋白的陽性表達率與HPV16/18感染呈正相關(Phi=0.533，P＜0.05)。

表3 HPV感染與P16表達的相關性Tab 3 The correlation between HPV infection and expression of P16

3 討論

人乳頭瘤狀病毒(HPV)與宮頸鱗癌發生的密切關系已經得到肯定。宮頸腺癌與高危型人乳頭狀病毒HPV16/18感染亦密切相關。本研究顯示宮頸管型腺癌及子宮內膜樣腺癌中HPV16/18的感染率均較高，與宮頸鱗癌相比差異無統計學意義(P＞0.05)，在宮頸鱗癌中主要以HPV16感染為主，而在宮頸腺癌中HPV16及HPV18的感染率大致相當。這與文獻［6］報道的宮頸鱗癌以HPV16感染為主，而宮頸腺癌以HPV18為主有差異，這可能與受檢者的地域、年齡、檢測方法都有一定的關系。

環化酶依賴性的激酶抑制蛋白P16與多種惡性腫瘤的發生、發展有關，故稱為多重腫瘤抑制基因(MTS1)，在正常細胞周期中，細胞周期素cyclin D1與細胞周期素依賴激酶4形成cyclin D1-CDK4復合物，致Rb磷酸化，使抑癌基因Rb失去抑制轉錄因子E2F啟動DNA合成的功能，導致細胞由G1期進入S期，細胞增殖。P16蛋白能與cyclin D1競爭性結合CDK4，抑制cyclin D1-CDK4復合物的活性，使細胞停滯于G1期，從而抑制細胞增生和惡性轉化。此外，在正常細胞中，存在著一個負反饋網絡，即磷酸化Rb增加時，可引起P16表達增強，增加的P16與cyclin D1競爭性地結合CDK4，從而抑制CDK4活性，抑制細胞增殖。因此P16基因在上述某一個環節發生異常，均可導致細胞異常增殖和腫瘤發生。

P16作為一個抑癌因素在許多惡性腫瘤中是失活的，但是在宮頸腫瘤中，卻一直沒有發現P16基因變異或P16蛋白失活。相反，在宮頸鱗癌、宮頸腺癌進行免疫組化染色時卻發現了P16的過度表達［7］。Milde-Langosch等［8］發現在 HPV陽性的宮頸腺癌中，P16蛋白的陽性率為93%，而在HPV陰性的宮頸腺癌中僅有41%表達P16蛋白，P16蛋白表達與宮頸腺癌中HPV16/18感染密切相關。本研究也證實了HPV16/18的感染率與P16蛋白的陽性表達率呈正相關(P＜0.05)。因此認為高危組的HPV所含有的E6、E7基因可整合入宿主的基因組內，進而分別使P53、Rb蛋白的功能失調，使宮頸上皮細胞的細胞周期發生紊亂，Rb通路失控，引起原本正常的P16蛋白反饋性高表達。

宮頸微偏腺癌(MDA)在宮頸腺癌中占1%－3%，其形態學上具有類似正常宮頸黏液腺的特征，而生物學行為卻表現為惡性，宮頸細胞學涂片甚至多次活檢可呈陰性，以至于不易早期發現。有文獻報道宮頸MDA特征性表達胃黏蛋白［9］，并且對宮頸MDA黏液成分的研究顯示其所含黏蛋白成分的比例與正常宮頸腺上皮不同［10］。我們先前的研究顯示宮頸MDA與其他類型腺癌中CEA、Ki-67的陽性表達率均較高，但與其他類型腺癌不同的是，宮頸MDA中特征性表達胃黏蛋白 MUC6［11］。我們對9例MDA的黏液特殊染色也發現:AB-PAS(奧辛藍－過碘酸雪夫氏)染色中MDA中腫瘤細胞的胞質主要被PAS染成紅色，而正常宮頸腺上皮細胞質均被染成紫色或紫羅蘭色;HID/AB(高鐵二胺－奧辛藍)染色中正常宮頸腺上皮細胞既有黑色著色部位，又有藍色著色部位，以黑色為主。MDA中兩種著色均減少，只見少量腺體呈淺藍色。因此我們推測宮頸MDA與胃黏膜上皮化生有關。Toki等［12］用聚合酶鏈反應技術檢測6例MDA的石蠟切片，僅發現1例HPV16陽性，HPV18均陰性，并且通過原位雜交聚合酶鏈反應技術，發現該陽性病例是一個低度鱗狀上皮內病損疊壓在MDA病灶上造成的。本實驗結果顯示，10例宮頸MDA中僅1例HPV16陽性，P16的陽性表達率亦低于其他組的宮頸癌組織，因此我們認為宮頸MDA可能是宮頸腺癌中的一種特殊類型，其病因及發病機制不同于常見的宮頸管型及子宮內膜樣腺癌，結合Hee等［13］以及 Xu等［14］的研究結果，我們有理由認為宮頸MDA可能與高危HPV16/18的感染無關。當然，在以后的研究中我們會收集更多的病例，檢測更多亞型的HPV，應用更先進的檢測技術進一步探討宮頸MDA的病因及發病機制。

［1］ Zheng T，Holford TR，Ma Z，et al.The continuing increase in adenocarcinoma of the uterine cervix:a birth cohort phenomenon［J］.Int J Epidemiol，1996，25(2):252 －258.

［2］ Smith HO，Tiffany MF，Qualls CR，et al.The rising incidence of adenocarcinoma relative to squamous cell carcinoma of the uterine cervix in the United States:a 24-year population-based study［J］.Gynecol Oncol，2000，78(2):97 －105.

［3］ Andersson S，Rylander E，Larsson B，et al.The role of human papillomavirus in cervical adenocarcinoma carcinogenesis［J］.Eur J Cancer，2001，37(2):246 －250.

［4］ Gusserow ALS.Ueber sarcome des Uterus［J］.Arch Gynakol，1870，1(2):240.

［5］ Hurt WG，Silverberg SG.Minimal deviation adenocarcinoma(adenoma malignum)of the cervix ，a reappraisal［J］.Am J Obstet Gynecol，1975，121(6):971 －975.

［6］ Clifford GM，Smith JS，Plummer M，et al.Human papillomavirus types in invasive cervical cancer worldwide［J］.Br J Cancer，2003，88(1):63 －73.

［7］ Negri G，Egarter-Vigl E，Kasal A，et al.P16INK4a is a useful marker for the diagnosis of adenocarcinoma of the cervix uteri and its precursors:an immunohistochemical study with immunocytochemical correlations［J］.Am J Surg Pathol，2003，27(2):187 －193.

［8］ Milde-Langosch K，Riethdorf S，Kraus-Poppinghaus A，et al.Expression of cyclin-dependent kinase inhibitors P16MTS1，p21WAF1，and p27KIP1 in HPV-positive and HPV-negative cervical adenocarcinomas［J］.Virchows Arch，2001，439(1):55 －61.

［9］ Ichimura T，Koizumi T，Tateiwa H，et al.Immunohistochemical expression of gastric mucin and p53 in minimal deviation adenocarcinoma of the uterine cervix［J］.Int J Gynecol Pathol ，2001，20(3):220－226.

［10］ Hayashi I，Tsuda H，Shimoda T.Reappraisal of orthodox histochemistry for the diagnosis of minimal deviation adenocarcinoma of the cervix［J］.Am J Surg Pathol，2000，24(4):559.

［11］ 張玲，王全紅.子宮頸微偏腺癌的蛋白表達［J］.腫瘤研究與臨床雜志，2008，20(4):237 －240.

［12］ Toki T，Zhai YL，Park JS，et al.Infrequent occurrence of high-risk human papillomavirus and of p53 mutation in minimal deviation adenocarcinoma of the cervix［J］.Int J Gynecol Pathol，1999，18(3):215－219.

［13］ Hee JA，Kyu RK，In SK，et al.Prevalence of human papillomavirus DNA in various histological subtypes of cervical adenocarcinoma:a population-based study［J］.Mod Pathol，2005，18(4):528－534.

［14］ Xu JY，Hashi A，Kondo T，et al.Absence of human papillomavirus infection in minimal deviation adenocarcinoma and lobular endocervical glandular hyperplasia［J］.Int J Gynecol Pathol，2005，24(3):296－302.

Expression of HPV16/18 and P16 in cervical adenocarcinoma and their correlation

ZHANG Ling1，LIU Feng2，WANG Quan-hong3(1Dept of Pathology，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China;2School of Forensic Medicine，Shanxi Medical University;3Dept of Pathology，Shanxi Tumor Hospital)

ObjectiveTo explore the infection of HPV16/18 in different types of cervical adenocarcinoma，and its correlation with expression of P16.MethodsHybridizationin situand EnvisionTMtwo-step method were used to evaluate the expression of HPV16/18 and P16 in 31 cases of endocervical adenocarcinoma，12 cases of endometrioid adenocarcinoma and 9 cases of minimal deviation adenocarcinoma.Thirty-six cases of squamous carcinoma of the cervix were chosen as controls.Results①The detection rate of HPV16/18 in minimal deviation adenocarcinoma was lower than that of the other cases(P＜0.05)，but there was no significant difference between endocervical adenocarcinoma，endometrioid adenocarcinoma and squamous carcinoma(P＞0.05).②The positive rate of P16 in minimal deviation adenocarcinoma was lower than that of the other cases(P＜0.05).③The positive expression of P16 in all HPV-positive cases was significantly higher than that in all HPV-negative cases.Positive expression of P16 was related to HPV16/18 infection(P＜0.05).Conclusion①The occurrence of endocervical adenocarcinoma and endometrioid adenocarcinoma of cervix are related to the infection of HPV16/18，but perhaps not for minimal deviation adenocarcinoma.②Overexpression of P16 may play an important role in the occurrence and development of some usual adenocarcinoma of cervix，but perhaps not in minimal deviation adenocarcinoma.③Overexpression of P16 is closely related to the infection of HPV16/18.

cervical adenocarcinoma;minimal deviation adenocarcinoma;HPV16/18;P16

R737.33

A

1007 －6611(2011)01 －0046 －04

10.3969/J.ISSN.1007 －6611.2011.01.012

張玲，女，1980－10生，碩士，講師，E-mail:zhanglingty@sohu.com.

2010－09－27］