川芎嗪對皮質神經元在氧糖剝奪損傷中的保護作用

王 菲 王廣生 強 輝 強 杰 陜西省第七建筑工程公司職工醫院(寶雞 721000）

川芎嗪對皮質神經元在氧糖剝奪損傷中的保護作用

王 菲 王廣生△強 輝▲強 杰△陜西省第七建筑工程公司職工醫院(寶雞 721000）

目的:探討川芎嗪對培養大鼠皮質神經元在氧糖剝奪損傷中的保護作用及可能機制。方法:原代培養新生大鼠皮質神經元,利用氧糖剝奪建立皮質神經元缺血再灌損傷模型。應用四甲基偶氮唑鹽(MTT）測定細胞活力。應用乳酸脫氫酶(LDH）、超氧化物歧化酶(SOD）活性及丙二醛(MDA）試劑盒分別檢測 LDH、SOD活性及 MDA含量。應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結果:氧糖剝奪損傷后細胞存活率降低,LDH釋放上升,SOD活性下降,MDA含量明顯增加,細胞凋亡率顯著升高(P＜0.05）。川芎嗪可濃度依賴性地提高細胞的存活率和 SOD水平,減少 LDH釋放和 MDA含量,抑制細胞凋亡(P＜0.05）。結論:川芎嗪對培養大鼠皮質神經元在氧糖剝奪損傷中有保護作用,其保護機制可能與葛根素穩定細胞膜,減輕氧化損傷,及抑制細胞凋亡有關。

缺血再灌注損傷的發生與氧自由基釋放、線粒體損傷、鈣離子超載、炎癥細胞的介入及參與細胞信號轉導的信號分子的激活等因素有關[1～3]。缺血再灌注損傷的共性為各種器官、組織、細胞遭受了病程久暫、輕重不同的缺氧及其后更為嚴重的復氧損傷。川芎嗪(Tetramethyl pyrazine,TMP）是從川芎等植物中分離出的一種生物堿單體,化學結構為四甲基吡嗪。研究發現,川芎嗪對中樞神經系統缺血 /再灌注損傷有明顯保護作用,但缺少離體細胞學的實驗證據,且保護作用機制尚不清楚。本實驗采用體外培養的皮質神經元為研究對象,以氧糖剝奪方法建立缺氧缺糖 /復氧復糖損傷的離體模型,觀察川芎嗪的神經保護作用并初步探討其作用機制。

1 材料與方法1.1 試劑和儀器 MTT,DMSO購自美國 Sigma公司;LDH檢測試劑盒,SOD檢測試劑盒及 MDA檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所 ;AnnexinV/FITC試劑盒購自上海晶美生物工程公司;川芎嗪(批號:H62021030）甘肅蘭藥藥業集團公司。二氧化碳培養箱(美國 SHELLAB公司）;倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司）;全自動酶標儀(美國BIO-TEK公司 ）;熒光分光光度計 (日本 Shimadzu公司）流式細胞儀(美國 Becton-Dickinson公司）。

1.2 大腦皮層神經細胞的培養 1～ 3天 SD大鼠,由西安交通大學實驗動物中心提供,并征得西安交通大學動物倫理委員會同意。無菌條件下分離 1-3天 SD大鼠的大腦皮層置于含 2.5g/L胰蛋白酶的 D-Hank’s液中,37℃消化 15分,加入含100ml/L牛血清的 DMEM/F12培養液中止胰酶的作用,移液管輕輕吹打為單細胞懸液,調整細胞密度為 (1～ 2）× 105個 /ml,接種于預先經多聚賴氨酸覆蓋的 96孔板中。接種的第 5～7天加人阿糖胞苷 (終濃度為 0.01mmol/L）處理 24小時以抑制膠質細胞的增殖。當接種細胞融合達 80%后,常規消化后傳代培養。取第 3代細胞進行鑒定及相關實驗。

1.3 體外缺氧缺糖 /復氧復糖(OGD-R）模型的建立 取生長期大腦皮層神經細胞,將培養液換成無糖 DMEM培養液,用 95%N2～～5%CO2混合氣驅趕培養液和培養板中的空氣,嚴密封口后 ,置于 37℃含 95%N2～ 5%CO2的密閉培養箱中,模擬缺血 ,4h后取出培養板,更換常規 DMEM培養液,并恢復正常培養環境,繼續培養 24h,模擬再灌注,建立細胞 OGD-R模型更換正常培養液時,TMP組同時加入相應濃度的 TMP。

1.4 細胞分組和處理 實驗隨機分為三組:對照組,OGD-R模型組,TMP組 (終濃度分別為 0.05μmol/L,0.1μmol/L和 0.2μmol/L）。 每組所用 96孔板的孔數 n=6。

1.5 指標的檢測 1.5.1MTT檢測:將細胞按 1×104/mL密度接種于 96孔培養板 ,分組處理如前所述。加入 5g/L的MTT20μL,37℃孵育 4h,離心后去除上清液,加入 150μL DMSO振蕩 5min,使結晶物充分溶解,置入酶標儀在 570nm檢測 A值。

1.5.2 LDH檢測:將細胞按 1×104/ml密度接種于 96孔培養板,分組處理如前所述。吸取待測 96孔板中的細胞培養液,按 LDH試劑盒說明書要求進行檢測。

1.5.3 :SOD活力及 MDA含量測定 將細胞以 106/ml的密度接種于 24孔板中,每孔 0.5mI,每組 5孔。收集細胞,超聲破碎細胞,離心后取上清待測,使用南京建成生物工程研究所檢測試劑盒,按說明書方法,測定 SOD活力及 MDA的含量。

1.5.4 流式細胞儀檢測凋亡:細胞培養,分組處理如前所述。按 AnnexinV-FITC/PI試劑盒操作說明檢測細胞凋亡。用2.5g/L胰蛋白酶消化各組細胞,用 4℃預冷的 PBS洗滌 2次,離心(1000r/min,5min）后除去細胞碎片,用結合緩沖液重懸細胞,調節其細胞數為 1.0× 106/mL。取細胞懸液 100μL于 5 mL流式管中,加入 AnnexinV-FITC5μL和 2μg/mLPI 10μL,混勻后室溫避光孵育 15min,應用流式細胞儀分析各組細胞凋亡率。

1.6 統計學處理 采用 SPSS13.0統計軟件包進行分析,所測值以均數±標準差(±s）表示,組間比較采用單因素方差分析。 P＜0.05,認為差異有統計學意義。

2 結 果2.1 TMP對細胞活力的影響 經各濃度TMP對正常大腦皮層神經細胞活力檢測發現,與正常細胞活力相比無差異(P＞ 0.05）,這說明 TMP在 0.05-0.2μmol/L的濃度范圍內對正常培養 PC12細胞沒有明顯影響。OGD-R后細胞活力由(100.13±9.72）%下降到(36.43± 5.87）%(P＜0.05）。 TMP可以減輕細胞損傷 ,按濃度 (0.05μmol/L、 0.1μmol/L、0.2μmol/L）其細胞活力分別提高到(45.21± 6.14）%,(64.22±7.81）%,(79.94±8.12）%,與 OGD-R組相比差異具有統計學意義(P＜0.05）。

2.2 TMP對細胞內 LDH的影響 結果如表 1所示,缺血能夠引起大腦皮層神經細胞胞內 LDH釋放,再灌注時加入TMP,能夠抑制 LDH釋放,而且隨著藥物濃度增加 LDH釋放量減少。

2.3 TMP對細胞內 SOD及 MDA的影響 與對照組相比,OGD-R降低了 SOD活性,當細胞再灌注加入 TMP處理后,SOD活性得到了明顯的提高。OGD-R后 MDA含量明顯增加,應用 TMP治療可顯著降低其含量,且隨著藥物濃度增加MDA含量也明顯減少(表 1）。

2.4 TMP對缺氧缺糖/復氧復糖細胞凋亡的影響 與對照組比較,OGD-R模型組細胞凋亡率明顯升高 (P＜0.01）。與模型組比較 ,TMP0.05μmol/L、 0.1μmol/L 和 0.2μmol/L 各濃度組細胞凋亡率降低,呈濃度依賴關系,差異有統計學意義(表 5）。

表1 TMP對細胞 LDH釋放、SOD活性及 MDA含量的影響

表2 TMP對細胞凋亡率的影響

討 論 整體動物模型研究由于易受體內外多種因素影響,使一些藥物研究的結果很不穩定,不利于藥物作用的正確評估。體外實驗采用神經細胞原代培養,模擬人體缺血缺氧狀態可以排除體內干擾,探討缺血性神經元損傷機制。模擬缺血性損傷的離體模型有多種方法,目前公認的是細胞缺氧合并培養基缺糖模型[4]。本實驗結果表明,氧糖剝奪模型可以較好的模擬體內缺血性損傷,具有起效較快、比氰化物等使用安全的特點,是制作缺血模型和用于簡單藥物評價的有利方法。

川芎嗪系川芎等植物中分離的一種生物堿單體,化學結構為四甲基吡嗪。近年研究發現,TMP可透過血腦屏障,通過阻滯鈣離子通道、清除氧自由基、影響內皮素和一氧化氮合成等對中樞神經系統產生多種作用,其應用價值得到廣泛承認[5]。已研究證明川芎嗪對中樞神經系統缺血再灌注損傷有明顯保護作用[6～10]。但目前缺少離體細胞學的實驗證據,且保護作用機制尚不清楚。

本實驗采用 MDA、SOD及 LDH等指標觀察 TMP對缺氧缺糖 /復氧復糖損傷神經細胞的影響。MDA是一種在缺氧狀態下生物膜中的多不飽和脂肪酸受自由基攻擊所形成的一種脂質過氧化物,測定 MDA的量常常可反映機體內脂質過氧化損傷的程度。SOD是以氧自由基連鎖反應前體物 O2-為唯一底物的天然酶類清除劑,構成了機體抗活性氧的第一道防線。MDA的高低間接反應了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度,而 SOD活力的高低直接反應了機體清除氧自由基的能力。乳酸脫氫酶(LDH）是一種細胞內標志酶,廣泛存在于各種組織細胞的胞漿中。當細胞受損時,細胞膜通透性發生改變,LDH釋放量明顯增加。因而檢測 LDH漏出量能夠定量評價細胞損傷程度[11]。MTT為淡黃色粉末,易被水溶解和透過細胞膜被活細胞內的琥珀酸脫氫酶還原,形成不溶于水的藍紫色結晶。該結晶可溶于 DMSO,通過分光光度計依顏色深淺可測定出各吸光度值,因此吸光度值大小可間接反映細胞存活數量及細胞活性。本實驗結果發現:缺氧缺糖/復氧復糖后細胞存活率降低,LDH釋放上升,SOD活性下降,MDA含量明顯增加;TMP可濃度依賴性地明顯提高缺氧缺糖 /復氧復糖損傷細胞的存活率和 SOD水平,減少 LDH釋放和 MDA含量。這提示 TMP能夠通過抗氧化作用發揮其對缺氧缺糖 /復氧復糖損傷細胞的保護作用。

缺血再灌注導致神經細胞損傷的機理十分復雜,涉及鈣離子超載、細胞凋亡、能量代謝障礙、興奮性氨基酸增多等多種復雜因素。研究發現細胞凋亡與腦缺血、腦缺血再灌注及某些退行性神經病變等有關[12～14]。其中,細胞凋亡是多種生理病理刺激引發的細胞自殺過程,是生物體內普遍存在的不同于壞死的生理性細胞死亡。細胞凋亡是一個漸進的過程,凋亡早期的細胞結構變化輕微,胞膜尚未破壞,此時通過治療干預手段仍能逆轉這部分細胞的功能。因此,針對早期凋亡細胞功能的保護作用,抑制凋亡過程的繼續,才是藥物作用的關鍵靶點。本實驗采用培養的神經細胞,建立缺氧損傷模型,應用瓊脂糖凝膠電泳檢測到 DNA梯帶,通過流式細胞儀檢測,發現 TMP可明顯降低再灌注損傷 PC12細胞凋亡率。提示 TMP對擬缺血再灌注PC12細胞的保護作用機制可能與其抑制凋亡有關。

綜上所述,川芎嗪對培養大鼠皮質神經元在氧糖剝奪損傷中有保護作用,其保護機制可能與葛根素穩定細胞膜,減輕氧化損傷,及抑制細胞凋亡有關。

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川芎嗪 /藥效學 大鼠 實驗研究

R28

A

1000-7369(2011）01-0108-04

△陜西省寶雞市華山醫院(寶雞 721000）

▲陜西省人民醫院(西安 710068）

(收稿 2010-08-09;修回 2010-09-12）