兩例凝血因子Ⅴ缺陷癥患者的基因分析

謝海嘯，王明山，牛真珍，謝耀盛

（溫州醫學院附屬第一醫院 實驗診斷中心，浙江 溫州 325000）

凝血因子V（coagulationg factor V，FV）是凝血過程中一種重要的輔因子，其活化形式FVa與Ca2+、磷脂和FXa形成的復合物是體內凝血酶原最主要的激活物。除了凝血功能，FV也通過輔助活化蛋白C下調活化因子VI I I間接參與生理性抗凝旁路途徑。FV的這一雙重作用，使得FV基因缺陷的臨床表現差異較大，可表現為出血、血栓形成，也可無明顯臨床癥狀[1]。我們發現了2例凝血因子V缺陷患者，現報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 患者1：女，62歲。白內障術前凝血常規篩查發現血漿凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶（APTT）顯著延長，分別為31.5和104.1 s。進一步做凝血因子活性檢測，發現FV:C為4%。患者無肝腎功能障礙，無出血病史，父母非近親結婚。

患者2：女，41歲。眼部翼狀胬肉切除術前凝血常規檢查發現PT 23.6 s、APTT 75.9 s，FV:C為5%。患者無出血病史，肝腎功能正常，父母亦非近親婚配。

正常對照組：50例，其中男27例，女23例，平均年齡34（18～60）歲，均為我院健康體檢者，經查均無肝腎功能疾病，無血栓或出血史，采樣前已征得本人同意。

1.2 方法

1.2.1 標本的采集和處理：在征得患者知情同意后，采集外周靜脈血，0.109 mol/L枸櫞酸鈉1:9抗凝，立即于3 000 r/min離心10 min后收集上層血漿用于凝血指標檢測，2 h內檢測完畢。剩余的血細胞-40 ℃凍存，用于DNA提取。

1.2.2 凝血相關指標檢測：法國STAGO全自動血凝儀檢測APTT、PT、纖維蛋白原（FIB）、FI I：C、 FV：C、FX：C。試劑由STAGO公司配套提供。所有操作步驟均嚴格按照試劑說明書進行。

1.2.3 血漿凝血因子V抗原（FV：Ag）檢測：采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法。綿羊抗人FV抗體為Cedarlane Laboratories Limited公司產品，辣根過氧化物酶標記的FV抗體的制備使用EZ-Link Plus Activated Peroxidase Kit（Pierce Biotechnology，Inc.公司產品）。血漿樣本1:200稀釋，酶標記抗體濃度為2μ g/mL，492 nm比色。以50人份正常對照混合血漿為100%，計算患者及家系成員FV：Ag含量。

1.2.4 FV基因測序：按常規酚-氯仿法抽提患者外周血基因組DNA。引物序列參照文獻[2]設計并由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR擴增FV的25個外顯子序列。PCR反應總體積為50μL，包括10×PCR Bufer，MgCl2（終濃度為 1.5 mmol/L），dNTP（終濃度為200μmol/L），2 U Taq DNA聚合酶，引物（終濃度為0.5μmol/L）。擴增條件：94 ℃，5 min，94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30～60 s，30～35個循環后，72 ℃，10 min。PCR產物在全自動測序儀上進行測序（美國Applera公司，ABI3730XL型）。

2 結果

2.1 凝血指標檢測 患者1 APTT 104.1 s、PT 31.5 s，均明顯延長，FV：C為4%，FV：Ag為2.6%。患者2 APTT 75.9 s、PT 23.6 s，亦明顯延長，FV：C為5%，FV：Ag為18.9%。見表1。

2.2 FV基因分析 通過Chromas軟件將2例患者FV基因測序結果與NCBI基因文庫AY364535序列進行比對（Blast）后，再與NCBI中的單核甘酸多態性數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp.ref.cgi?locusId=2153）比對。2例患者共發現了8個基因多態性位點，其中有4個共同的多態性位點均在B區，分別為Lys858Arg、His865Arg、Lys925Glu和Pro1404Ser。具體見表2。

表1 2例FV缺陷患者凝血指標項目檢測結果

表2 2例FV缺陷癥患者基因分析結果

3 討論

遺傳性凝血因子V缺乏是一種罕見的常染色體隱性遺傳性疾病，發病率為百萬分之一[3]。FV基因位于人類1q21～25上，由25個外顯子和24個內含子組成，長度約80 kb，成熟FV蛋白結構為A1-A2-B-A3-C1-C2，FV在凝血酶或FXa的作用下，在第709、1018和1545位精氨酸處發生裂解，切去其B結構域，活化成為FVa，形成由A1、A2區組成的重鏈和A3、C1、C2區組成的輕鏈所構成的異二聚體。FV缺陷癥主要分為兩型：I型為CRM-，交叉反應物質陰性，即FV抗原（FV：Ag）和活性（FV：C）同步減少；I I型為CRM+，FV：C極低而FV：Ag正常，其產生了無功能或是功能異常的FV蛋白。本研究結果，患者1，FV：C為4%，FV：Ag為2.6%，CRM-。患者2，FV：C為5%，FV：Ag為18.9%，抗原水平稍高，為非典型的CRM-。有趣的是，兩人FV：C與FV：Ag水平都很低，診斷為FV缺陷，但皆無明顯的臨床癥狀，且除了較多的多態性位點外，目前尚未發現其他突變。

曹麗娟等[4]曾報道兩病例具有相同的FV活性和抗原含量，皆為2%，但臨床表現卻有很大的不同，患者1自出生起出現周期性自發性鼻出血，患者2卻一直無癥狀。FV抗原和活性的含量與臨床表現之間沒有很好的一致性，目前還沒有合理的理論來解釋這一點。FV的下降并不是決定FV缺陷患者臨床癥狀輕重的唯一因素。有學者推測可能存在一種未知的調節因子或機制[5]。

本研究2例FV缺陷患者，基因分析未發現其他突變，而只有8個基因多態性位點，國內外文獻未報道過類似病例。2例患者同時擁有Lys858Arg、His865Arg、Lys925Glu和Pro1404Ser這4個多態性位點，且均位于B結構域。長期以來，人們對B區的功能不夠重視，因為FV活化為FVa時，B區是被切除而游離出來。但凝血酶激活FV的3個位點都位于B區，B區對于FV活化是必要的。Yamazaki等[6]曾報道Met385Thr、His1299Arg、Met1736Val和Asp2194Gly這4種多態性，并對其作了體外表達研究，發現這4種多態性同時存在時，FV的表達水平比野生型顯著降低，細胞培養液中FV表達水平僅約為野生型的20%，其原因是變異的蛋白質合成率明顯降低且伴分泌障礙，其中Asp2194Gly是造成分泌障礙的關鍵因素。故推測本研究2例患者B區多態性位點的疊加可能與FV缺陷有關或是某一兩個位點起主要作用，具體機制有待進一步研究。

另外患者2 FV：C為5%，FV：Ag為18.9%，抗原水平稍高，為非典型的CRM-，推測其多態性除了導致FV分泌障礙外，還可能有蛋白正常功能的缺失。由于FV基因龐大，基因結構比較復雜，其龐大的內含子區序列突變也可能對其功能產生影響。僅僅通過對外顯子區的測序分析，一些FV缺陷癥的基因缺陷還是不能被完全確認。因此，對患者的FV基因外顯子側翼含拼接點的內含子進行測序分析是必要的，以期發現新的有意義的突變。

[1] Mannnucci PM,Duga S,Peyvandi F.Recessively inherited coagulation disorders[J].Blood,2004,104(5):1243-1252.

[2] Fu QH,Zhou RF,Liu LG,et al.Identification of three F5 gene mutations associated with inherited coagulation factor V deficiency in two Chinese pedigree[J].Haemophilia,2004,10(3):264-270.

[3] Kalafatis M.Coagulation factor V:a plethora of anticoagulant molecules[J].Curr Opin Hematol,2005,12(2):141-148.

[4] 曹麗娟,王兆鉞,蘇雁華,等.兩例先天性凝血因子V缺乏癥基因突變的鑒定[J].血栓與止血學,2007,13(1):17-19.

[5] Wilk R,Nieuwenhuis K,Berq M, et al.Five novel mutations in the gene for human blood coagulation factor V associated with type I factor V deficiency[J].Blood,2001,98(2):358-367.

[6] Yamazaki T, Nicolaes GA, Sorensen KW, et al. Molecular basis of quantitative factor V de?ciency associated with factor V R2 haplotype[J]. Blood,2002,100(7):2515-2521.