NCAM L1小基因模型的建立及其剪接模式研究

張 薇，沈 權，彭正羽

NCAM L1小基因模型的建立及其剪接模式研究

張 薇1，沈 權1，彭正羽2

(1.浙江大學城市學院醫學與生命科學學院，浙江杭州310015;2.復旦大學生物醫學研究院，上海200032)

目的：建立可用于前體mRNA可變剪接分析的NCAM L1小基因模型。方法：以人基因組DNA為模板，通過PCR擴增獲得NCAM L1小基因片段，并將其克隆至真核表達載體中，構建小基因的質粒。在此基礎上，用NCAM L1小基因模型轉染HeLa、COS-1、PFSK及R28細胞，并用RT-PCR進行被剪接的小基因產物的半定量檢測。結果：NCAM L1小基因在4種細胞中的剪接模式不同，在PFSK以及Hela細胞中，存在2種剪接亞型，而在COS-1以及R28細胞中只有一種剪接亞型存在。結論：所構建的NCAM L1小基因可用于細胞水平的基因剪接分析。

Hela細胞;質粒;遺傳載體;剪接體;NCAM L1;小基因;前體mRNA;可變剪接

［JZhejiang Univ(Medical Sci)，2011，40(4):427-431.］

前體mRNA的剪接是基因表達調控中的重要環節，目前已知兩種互相關聯的剪接方式:組成性剪接和可變剪接［1］。在組成性剪接中，剪接位點不因細胞種類發育階段或環境而改變，因而最終形成的基因及其表達產物也是不變的。而可變剪接則不然，通過可變剪接過程可以將前體mRNA的外顯子選擇性地組合、連接在一起，并最終表達出功能各異的、甚至完全相反的蛋白質亞型［2］。前體mRNA的剪接是在“剪接復合體”中進行的，剪接復合體包含snRNPs(small nuclear ribonucleoproteins)、hnRNPs(hetero-geneous nuclear ribonucleoproteins)和 SR(serine/arginine-rich)蛋白及其相關蛋白［3-4］。調控可變剪接的因素包括順式元件和反式調節因子［5-6］。

在前體mRNA可變剪接的研究中，小基因模型是一種新發展起來的有效的研究手段［7-8］。所謂小基因是基因中的一個片段，可用于基因的功能以及表達調控機制研究，因其片段短而得名。用于組成型剪接分析的小基因模型通常僅包含2個外顯子和它們之間的1個內含子;用于可變剪接分析的小基因除包含2個相鄰的在剪接時被二選一剪接的外顯子外，還包含它們兩側的外顯子及這些外顯子之間的內含子。

人神經細胞黏附分子(Human Neural cell adhesion molecule L1，NCAM L1)屬于免疫球蛋白超家族的成員［9］，其在神經元細胞以及其它細胞中的表達存在差別，表現在對2號外顯子以及27號外顯子的可變剪接方式不同。在神經元細胞中，成熟的NCAM L1 mRNA包含2號外顯子以及27號外顯子，而在非神經元細胞中，成熟的NCAM L1 mRNA不包含2號外顯子和27號外顯子［10］。研究者已經證實，NCAM L1在神經細胞的分化以及遷移中發揮重要作用，同時，在腫瘤的發生以及轉移中也有作用［11-12］。

為深入研究NCAM L1的可變剪接機制，本研究建立了NCAM L1其2號外顯子可被可變剪接的小基因模型(小基因結構及其剪接模式見圖1)，并研究了該小基因模型在Hela、COS-1、PFSK及R28等幾種不同細胞系中的可變剪接模式，證實該小基因模型可以用于細胞水平的基因剪接分析。

圖1 NCAM L1小基因結構及其剪接模式Fig.1 The structure and splicing pattern of NCAM L1 minigene

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑 Taq酶、XbaⅠ、BamHⅠ內切酶和T4 DNA連接酶購自New England公司;MLV-RT酶以及 RNasin，dNTPs購自 Promega公司;oligo(dT)18購自上海生工生物工程有限公司;細胞轉染用 Lipofectiamine試劑盒購自GIBCO/BRL公司;PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.2 質粒 pCRII質粒以及 pcDNA3.1/myc-His(-)A表達載體購自Promega公司。

1.1.3 菌株 DH5α 為Clontech公司產品。

1.1.4 細胞株 Hela、COS-1、PFSK 及 R28細胞均來源于 ATCC，Hela、COS-1及 R28用含10%小牛血清的RPMI 1640培養液，37℃，5%CO2培養。PFSK用含10%小牛血清的DMEM高糖培養液，37℃，5%CO2培養。

1.2 實驗方法

1.2.1 小基因質粒的構建和驗證 在NCAM L1小基因兩端設計相應的引物，其中正向引物含有內切酶BamHⅠ的酶切位點，反向引物含有內切酶XbaⅠ的酶切位點。引物序列為:正向(L1-F):5'-ACGGATCCGATGGTCGTGGCG CTGCGG-3';反向(L1-R):5'-GCTCTAGAGGCT GAGACGGCAGATCAC-3'。以胎兒腦組織基因組DNA為模板，上述序列為引物進行PCR擴增，反應條件為 94℃變性5 min;94℃，30 s;64℃，30 s;72℃，5 min;35 個循環，72℃，7 min，擴增出一條約3.3 kb的小基因序列，將其克隆到載體pCRⅡ中并測序驗證。用這兩種內切酶對PCR產物進行酶切后即可克隆入pCDNA3.1質粒載體。質粒經過酶切以及測序鑒定為含有 NCAM L-1的 Exon1、2、3以及Intron的小基因。

1.2.2 細胞的短暫共轉染 將含有NCAM L1小基因的表達質粒pcDNA3.1-NCAM L1，轉染Hela、COS-1、PFSK及 R28細胞，以觀察在不同類型細胞中小基因的剪接情況。實驗中以小基因的空載體pcDNA3.1轉染的細胞作為陰性對照。細胞轉染通過lipofectamine介導，方法參見GIBCO/BRL公司操作說明。大致步驟為:在直徑6 cm的細胞培養皿中以5×105細胞/皿的密度接種細胞，次日以小基因質粒2 mg分別轉染不同細胞，30 h后收集細胞，抽提RNA，經逆轉錄獲得相應的cDNA。以上述cDNA為模板，載體上的T7 primer作為正向引物，上述的反向引物通過PCR擴增細胞外源性的NCAM L1的剪接產物。通過電泳條帶以及測序鑒別其可變剪接結果。

2 實驗結果

2.1 用于剪接分析的小基因的構建和驗證所構建小基因表達質粒pcDNA3.1-His-NCAM L1的酶切驗證結果見圖2。用BamHⅠ+XbaⅠ雙酶切后，得到3.3 kb的小基因片段和5.4 kb的載體片段，兩個片段的分子量均和理論上預期的相符，且與PCR擴增目的條帶大小一致。上述結果表明，所構建的小基因表達質粒準確無誤。

2.2 在不同細胞中NCAM L1小基因的剪接模式 用我們構建的小基因分別轉染Hela、COS-1、PFSK及R28細胞后，NCAML 1小基因的可變剪接結果見圖3。如圖所示，在PFSK細胞以及Hela細胞中，NCAM L1小基因的剪接產物為大小分別約為190 bp以及170 bp的兩個條帶，測序結果證實這兩個條帶中，分子量較大的條帶包含2號外顯子，而另一條帶不含2號外顯子。結果說明在這兩種細胞中，小基因可以被剪接產生兩種亞型，即包含2號外顯子以及不含2號外顯子的剪接亞型。而在R28以及COS-1細胞中，只存在一種大小為170 bp的條帶，說明小基因在這兩種細胞內通過剪接只能產生一種亞型，即不含2號外顯子的剪接亞型。

圖2 小基因質粒酶切電泳鑒定Fig.2 NCAM L1 minigene identification by BamHⅠ and XbaⅠ digestion

圖3 NCAM L1小基因在不同細胞中的剪接模式Fig.3 The splicing pattern of NCAM L1 minigene in 4 cell lines

3 討論

人類基因組計劃研究表明，人類的基因組包含約40 000個基因［13］，但是人體內蛋白的種類遠遠多于此數。其主要原因即在于基因可變剪接的多樣性，使這些基因的編碼容量大大增加。研究證實，同一基因在不同的條件下，可以編碼的亞型最多可達數千個［14］。最近的研究表明，超過70%的人類基因都有兩個或更多的剪接亞型存在［15］。可變剪接不僅存在于生命體的正常生理活動，如發育、分化以及性別決定等過程中，還在一些疾病特別是腫瘤的發生中也扮演著重要角色。如多位作者證實，成纖維細胞生長因子受體(FGFR)信號轉導途徑可能在星形膠質瘤的惡化過程中發揮重要作用［16］。FGFR1的α外顯子經過可變剪接可以產生兩種亞型，即包含α外顯子的FGFR1α以及不含α外顯子的FGFR1β。FGFR1在正常的蛋白質以及低級別的星形細胞瘤中表達很少或無表達，但在惡性膠質瘤中的表達較高且只表達可變剪接亞型FGFR1β。中間程度的膠質瘤FGFR1的表達則是由 FGFR1α到 FGFR1β變化［17］。

NCAM L1主要以同親和或異親和等多種方式實現神經元間相互作用，從而影響細胞遷移和神經元軸、樹突投射及突觸定位，以及作為輔助受體參與細胞內信號傳導［18］。NCAML1細胞黏附分子缺陷的小鼠會出現發育遲滯、空間學習和探索能力不足等表現［19］。此外，NCAM L1還參與腫瘤細胞侵襲［20］，在神經膠質瘤中，Izumoto等人在膠質瘤細胞中檢測到了NCAM L1的剪接亞型NCAM L1cs的表達，并發現該亞型可能在膠質瘤細胞的黏附以及遷移中發揮重要作用［21-22］，提示 NCAM L1的可變剪接與膠質瘤的生物學特性相關。相比體外基因剪接分析模型，體內小基因剪接分析方法建立在細胞水平上，更接近其在生物體內的真實情況。因此，本研究構建了NCAM L1的小基因模型，并將其轉染到 PFSK、Hela、R28以及COS-1細胞中。R28是一種永生化的視網膜前體細胞，而COS-1細胞來源于非洲綠猴腎細胞，均非腫瘤細胞，NCAM L1小基因通過可變剪接后只存在一種不含2號外顯子的剪接亞型，與其在正常組織中的剪接一致。而PFSK是來源于人類的原始神經外胚層腫瘤細胞，Hela是人類宮頸癌細胞，NCAM L1小基因通過剪接后能產生兩種剪接亞型，提示這種剪接形式可能與腫瘤相關。因此，通過研究NCAM L1小基因在不同的細胞中不同的剪接模式，將有助于我們研究NCAM L1在正常生理條件下以及包括神經膠質瘤在內的疾病中的作用及其分子機制。

［1］ GREEN M J.Biochemical mechanism of constitutive and regulated pre-mRNA splicing［J］.Annu Rev Cell Biol，1991，7:559-599.

［2］ REED R.Mechanisms of fidelity in pre-mRNA splicing［J］.Curr Opin Cell Biol，2000，12(3):340-345.

［3］ GRAVELEY B R.Alternative splicing:increasing diversity in the proteomic world ［J］.Trends Genet，2001，17(2):100-107.

［4］ NILSEN T W.The spliceosome:the most complex macromolecular machine in the cell ［J］.Bioessays，2003，25:1147-1149.

［5］ JURICA M S AND MOORE M J.pre-mRNA splicing:awash in a sea of proteins［J］.Mol Cell，2003，12:5-14.

［6］ BLACK D L.Mechanism of alternative premessenger RNA splicing［J］.Annu Rev Biochem，2003，72:291-336.

［7］ THANARAJ T A，STAMM S.Prediction and statisticalanalysis of alternatively spliced exons［J］.Prog Mol Sub Biol，2002，31:1-31.

［8］ GREGORY M H.Alternative splicing as a novel of means of regulating the expression of therapeutic genes［J］.Cancer Gene Therapy，2002，9:133-141.

［9］ FIELDSR D AND ITOH K.Neural cell adhesion molecules in activity-dependent development and synaptic plasticity［J］.Trends Neurosci，1996，19(11):473-480.

［10］ CHEN S，MANTEI N，Dong L，et al.Prevention of neuronal cell death by neural adhesion molecules L1 and CHL1 ［J］.J Neurobiol，1999，38(3):428-439.

［11］ MARETZKY T，SCHULTE M，LUDWIG A，et al.L1 is sequentially processed by two differently activated metalloproteases and presenilin/gammasecretase and regulates neural cell adhesion，cell migration，and neurite outgrowth ［J］.Mol Cell Biol，2005，25(20):9040-9053.

［12］ BAO S，WU Q，LI Z，et al.Targeting cancer stem cells through L1 CAM suppresses glioma growth［J］.Cancer Res，2008，68(15):6043-6048.

［13］ VENTER JC，ADAMSM D，MYERSE W，et al.The sequence of the human genome［J］.Science，2001，291:1304-1351.

［14］ GRAVELEY B R.Alternative splicing:increasing diversity in the proteomic world ［J］.Trends Genet，2001，17(2):100-107.

［15］ JOHNSON J M.Genome-wide survey of human alternative pre-mRNA splicing with exon junction microarrays［J］.Science，2003，302(5653):2141-2144.

［16］ JIN W，MCCUTCHEON I E，FULLER G N，et al.Fibroblast growth factor receptor-1 alpha-exon exclusion and polypyrimidine tract-binding protein in glioblastoma multiforme tumors［J］.Cancer Res，2000，60(5):1221-1224.

［17］ DEL GATTO F，PLET A，GESNEL M C，et al.Multiple interdependent sequence elements control splicing of a fibroblast growth factor receptor 2 alternative exon ［J］.Molecular and Cellular Biology，1997，17:5106-5122.

［18］ SCHMID R S，MANESS P F.L1 and NCAM adhesion molecules as signaling coreceptors in neuronal migration and process outgrowth ［J］.Curr Opin Neurobiol，2008，18(3):245-250.

［19］ CREMER H，CHAZAL G，LLEDO P M，et al.PSA-NCAM: an important regulator of hippocampal plasticity［J］.Int J Dev Neurosci，2000，18(2-3):213-220.

［20］ GAVERT N，BEN-SHMUEL A，RAVEH S.L1-CAM in cancerous tissues［J］.Expert Opin Biol Ther，2008，8(11):1749-1757.

［21］ IZUMOTO S，OHNISHI T，ARITA N，et al.Gene expression of neural cell adhesion molecule L1 in malignant gliomas and biological significance of L1 in glioma invasion ［J］.Cancer Res，1996，56(6):1440-1444.

［22］ SENNER V，KISMANN E，PüTTMANN S，et al.L1 expressed by glioma cells promotes adhesion but not migration ［j］.Glia，2002，38(2):146-154.

Establishment of NCAM L1 minigene model and its splicing patterns in different cell lines

ZHANG Wei1，SHEN Quan1，PENG Zheng-Yu2
(1.School of Medicine and Life Science，Zhejiang University City College，Hangzhou 310015，China;2.Institute of Biomedical Sciences，Fudan University，Shanghai 200032，China)

Objective:To establish a minigene model of neural cell adhesion molecule L1(NCAM L1)gene and to study its aplicing patterns in different cell lines.Methods:Using human genetic cDNA as template，the NCAM L1 minigene fragment was amplified and inserted into eukaryotic expression vector.The minigene was transfected into 4 cell lines and the splicing patterns of NCAM L1 minigene in these cell lines were studied.Results:The splicing patterns of NCAM L1 minigene were different in individual cell lines.In PFSK and Hela cell lines，two splicied isoforms were generated but in COS-1 and R28 cell lines，only one isoform existed.Conclusion:NCAM L1 minigene model can be used in alternative splicing analysis.

Hela cells;Plasmids;Genetic vectors;Spliceosomes;NCAM L1;Mini-gene;Pre-mRNA;Alternative splicing

Q 753

A

1008-9292(2011)04-0427-05

http:∥www.journals.zju.edu.cn/med

10.3785/j.issn.1008-9292.2011.04.014

2011-04-18

2011-05-15

浙江省教育廳科研資助項目(Y201017203).

張 薇(1976-)，女，碩士，講師，主要從事分子生物學和細胞免疫學研究.

彭正羽(1970-)，男，博士，主要從事分子生物學研究;E-mail:zhypeng@fudan.edu.cn

［責任編輯 張榮連］