基于病證結合的中藥網絡藥理學研究與新藥研發策略＊

何小娟，李 健，陳 杲，鄭 光，呂 誠，呂愛平△

(1.中國中醫科學院中醫臨床基礎醫學研究所，北京 100700;2.北京中醫藥大學基礎醫學院人體形態系，北京 100029)

近年來，人們對藥物研發的要求不斷提高，新藥研發的難度也隨之加大。2010年，僅有21種新藥通過美國 FDA的評審[1]，歐洲藥品管理局(EMA)也僅批準了14個新藥[2]:一批新上市的藥物因安全性或不良反應遭到撤市，一些被認為很具潛力的新藥在II、III期臨床研究時因安全性或有效性等問題慘遭淘汰，給新藥研發企業帶來巨大經濟損失，也讓整個制藥業在持續繁榮后面臨“低谷”和衰退[3]。

傳統新藥發現及研發所遵循的“單基因-單靶點-單疾病”的“線性”模式遇到巨大“瓶頸”及嚴峻“挑戰”。隨著“組學”(omics)技術的發展完善，系統生物學(system biology)及多向藥理學(polypharmacology)廣泛應用于重大疾病及藥理、毒理等研究。系統生物學的研究發現，生命體系具有高度的自穩定功能，其結構基礎是生物信號通路及其相互作用的復雜網絡拓撲結構[4]。許多復雜性疾病，如心血管疾病、腫瘤、類風濕性關節炎、糖尿病等是由多基因、多功能蛋白相互作用紊亂而形成的疾病網絡。干預疾病網絡中的一個或幾個節點(除非是高度鏈接的關鍵節點)對整個疾病網絡幾乎沒有影響[5]。而藥物(即使是單一化合物)的生物學作用也對應著相應的復雜分子網絡，并非作用單一靶 點[6、7]。 為 此， “ 網 絡 藥 理 學 ”(network pharmacology)融合了系統生物學及多向藥理學的思想并迅速發展，成為當前新藥發現和新藥創制的新型研究策略，不僅顯著提高新藥發現的效率和成功率，而且給藥物研發帶來哲學方法及研究模式的革命性轉變，給當前新藥發現面臨的困境帶來了新的希望。

網絡藥理學的概念由英國鄧迪大學藥理學家Andrew L.Hopkins于2007年首次系統闡述，是建立在高通量組學數據分析、計算機虛擬計算及網絡數據庫檢索基礎上的生物信息網絡構建及網絡拓撲結構分析策略和技術[8、9]。近幾年，歐美國家的研究人員依托較為公認的網絡信息資源，如drugbank數據庫收錄的小分子藥物及藥物靶點蛋白信息[10]、KEGG中代謝及基因表達信息[11]、Pubchem中化合物結構信息及 Pubmed中文獻知識信息等[12]，構建了多種藥物靶點網絡(drug-target network)[13]、人類疾病基因網絡(the human disease network)[14]及“蛋白質-蛋白質”相互作用網絡(protein-preotein interaction network，PPI)[15];同時開發了一系列用于網絡拓撲結構分析的算法及軟件工具，為開展網絡藥理學研究奠定了基礎，使網絡藥理學有望成為新藥研發中的常規研究策略。

中醫治病注重辨證論治，強調從整體把握病因、病機的傳變規律;而方劑配伍則注重“君臣佐使”，通過多味中藥的互相配合來實現對機體失衡狀態的修正。中醫藥學的這些理念體現了多成分、多靶點及系統調控的思想，與網絡藥理學的研究思路有許多相似之處[16]。借鑒經典網絡藥理學的方法，研究者可以從臨床典型證候患者的組學信息中可構建證候對應的生物網絡，即“病-證相關網絡”;進而從單味藥及傳統方劑中可發現有效成分組，進而針對多靶標設計、發現中藥新藥。上述基于病證結合的中藥網絡藥理學研究有望形成具有中醫藥特色的創新藥物設計理論，促進中藥現代化及國際化進程。本文以類風濕性關節炎(RA)為例，概述基于病證結合的中藥網絡藥理學研究策略及方法。

1 基于寒熱證候分類的RA疾病網絡構建

我們以往收集年齡24歲～64歲之間，女性，RA患者及健康人的外周血CD4 T淋巴細胞，利用基于基因芯片的基因組學技術，對相關數據進行了分析及網絡構建。全部基因組學數據經標準化處理、統計分析獲取特異表達基因(＞1.2 fold)，并綜合BIND(biomolecular interaction network database)、BioGRID(the general repository for interaction datasets)，DIP(databaseof interacting proteins)，HPRD(human protein reference database)，MINT(molecular interactions database)等數據庫信息及來自文本挖掘數據，初步構建了RA寒熱證候的蛋白質與蛋白質相互作用(PPI)網絡[17](圖1)。

圖1 RA寒熱證候網絡圖

2 基于數據挖掘技術的RA藥物靶標網絡構建

以“類風濕性關節炎”為關鍵詞在中國生物醫學文獻數據庫(SinoMed)中檢索全部文獻數據[18]。同時，以“rheumatoid arthritis”為關鍵詞在美國國立圖書館醫學文獻數據庫(PubMed)中檢索全部文獻數據。經XML數據集分析轉換工具軟件將上述數據轉換成格式化數據存儲于大型關系型數據庫MS SQL中，用于敏感關鍵詞頻數統計的離散導數計算[19]。從構建好的MS SQL數據庫中抽出與RA發病相關的敏感基因及蛋白數據，輸入IPA(http://analysis.ingenuity.com)網絡軟件，構建 PPI網絡。進而從MS SQL數據庫中抽出與RA治療相關的藥物信息(包括中藥方劑、中成藥、單味藥、單體化合物及西藥)，構建病證相關RA治療有效的中藥網絡、癥狀網絡及西藥網絡。通過網絡比對、分析獲取候選藥物或藥物組合。最后將藥物網與靶標網做疊加比對(overlap)，預測候選藥物或組合所對應的靶標(drug-target sub-network)，如圖2。

圖2 基于敏感關鍵詞頻數統計分析構建的

3 基于PubChem數據庫反向推測及正向預測RA治療藥物

應用數據挖掘技術(同2)構建不同證候RA相關的蛋白數據庫和化合物(小分子治療藥物)數據庫，隨后在PubChem數據庫中搜索與之結構近似的化合物及其生物活性信息，構建藥物-靶點網絡(drug-target network)，反向推測最佳治療藥物或藥物組合。檢索文獻數據及實驗實證數據，獲取治療不同證候RA的經驗方或中成藥中已知活性化合物，與構建的藥物-靶點網絡比對(docking)，正向預測中藥復方、中成藥的藥理機制或毒理機制(圖3)。

圖3 組合藥物的藥物靶標網絡

4 網絡拓撲結構分析及網絡平衡分析

網絡拓撲結構及網絡平衡分析是網絡藥理學最關鍵的技術，通過網絡分析可以客觀、準確的找出具有特定生物功能的關鍵節點、子結構，明確藥物干預的主要靶點、次要靶點和協同靶點，理解網絡達到平衡狀態涉及的亞網絡間關系，為預測干預藥物提供理論計算的參考。需要指出的是，功能相對完善的網絡藥理學專業工具軟件還沒有出現，網絡分析算法也處于探索過程中。現有較成熟的網絡分析軟件很多:如(1)Random walk工具，其原理是以明確的任意一個節點出發，隨機計算該節點與其鄰近節點的相似性，用來構建簡單的疾病-靶點-藥物網絡，揭示網絡各個節點間的相關性;(2)Prince工具，其工作原理是以確定的疾病為計算基線，收集與該病具有不同相似度的其他疾病，構建參考關聯網絡。利用已有數據庫信息構建與目標疾病相關的PPI網絡，并將該PPI網絡代入疾病關聯網絡，利用迭代算法，計算蛋白點之間信息流量并打分;(3)Cipher軟件，是針對人類疾病基因組學分析研發的專業軟件，可以利用基因組學信息整合人類表型-蛋白網絡、基因-表型網絡，并計算表型與基因之間的線性相關性、一致性;(4)Pajek軟件，其工作原理是把與疾病相關的靶點作為信息流的種子，在各種數據庫中進行高通量檢索分析，構建與之相關的候選子網絡，并分別為之賦值，對得分高的子網絡進行試驗驗證。

與上述分析工具相關的算法主要有:網絡節點間最短路徑計算;節點中心性分析，如分析節點度、緊密度、發散度、偏心度、圖心數、張力、介數等;最大節點流量路徑搜索;節點重要性排序，如中信節點;中間態集中度及聯接集中度分析;網絡比較分析;PPI網絡中功能模塊兒識別等。然而，網絡藥理學畢竟是新興學科，現有的分析工具及計算方法都有待于進一步完善，其所依賴的共享數據資源有待于系統、全面的積累，數據格式及標準也需要進一步統一。盡管存在諸多不足，網絡藥理學方法將成為聯系傳統中藥藥理、現代中藥藥理及新藥創制的橋梁。

5 實驗驗證

用網絡藥理學方法可以高效的預測針對靶點網絡的新藥物組合、發現潛在新藥。然而，這些潛在新藥中哪些能最終進入研發程序還取決于實驗驗證的結果。在實驗驗證環節，研究者常利用基因雙敲除或多敲除動物來模擬關鍵靶點網絡缺失，繼而評價藥物組合對網絡平衡的調節作用。由于中藥具有多組分、多靶點的特點，研究者通常采用細胞模型對各組分間相互作用進行高通量觀察，明確中藥中主效應成分及次效應成分、量-效關系、時-效關系等。需要指出的是，目前對網絡藥理學預測結果進行實驗驗證還有很多難點等待被突破:如跨實驗平臺的實驗驗證結果很難做到一致性、在實驗動物上還無法實現對一個靶點網絡的敲除等。

綜上，中藥中蘊藏著巨大的新藥創制資源，是未來多靶點藥物發現的源泉。網絡藥理學的研究策略符合中醫藥學對疾病本質的認識，有望在傳統方劑及中成藥的基礎上，發現新的藥物組合和新藥物靶標，實現“老藥新用”。此外，利用網絡藥理學反向推測及正向預測技術可發現一系列中藥有效成分組或有效成分群，為中藥復方優化、精制提供理論依據和方法學上的指導。除了新藥研發領域的應用，中藥網絡藥理學在中藥復方作用機制、方劑配伍規律、中藥毒理、中醫基礎理論內涵等研究中也將發揮重要作用。

中藥網絡藥理學剛剛起步，不僅在研究策略及研究方法上需要本質性的突破，而且在關鍵技術方面也期待創新和發展。值得高興的是，我國的網絡藥理學研究進展很快，一些相對穩定的研究團隊正在形成。科技部“十二五”新藥創制科技重大專項將“網絡藥理學及相關軟件技術研究關鍵技術”列入招標計劃，相信在不久的將來網絡藥理學將成為未來新藥創制的常規方法，而基于中醫理論的中藥網絡藥理學將推動中醫藥傳承與創新，促進中藥現代化和國際化的進程。

[1]http://www.fda.gov.

[2]http://www.ema.europa.eu.

[3]國際新藥研發前景展望(上).中國醫藥報.2011，3，16.

[4]Csermely P，Aggoston V，Pongor S.the efficiency of multi-target drugs:the network approach might help drug design.Trends Pharmacol Sci.2005;26(4):178-182.

[5]Sams-Dodd F.Target-based drug discovery:is something wrong?Drug Discov Today.2005;10(2):139-147.

[6]Wermuth CG.Multitargeted drugs:the end of the‘one-targetone-disease’philosophy?Drug Discov Today.2004;9(19):826-827.

[7]Kohanski MA， Dwyer DJ， Collins JJ. How antibiotics kill bacteria:from targets to networks.Nat Rev Microbiol.2010;8:423-435.

[8]Hopkins AL.Network pharmacology.Nat Biotechnol.2007;25(10):1110-1111.

[9]Hopkins AL.Network pharmacology:the next paradigm in drug discovery.Nat Chem biol.2008;4(11):682-690.

[10]http://www.drugbank.ca.

[11]http://www.genome.jp/keg.

[12]http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

[13]Muhammed A Yildirim，Kwang-lI Goh， Michael E Cusick，Albert-Laszlo Barabasi，Marc Vidal.Drug-target network.Nature Biotechnology.2007;25(10):1119-1126.

[14]Kwang-lI Goh，Michael E.Cusick，David Valle，Barton Childs，Marc Vidal， Albert-Laszlo Barabasi. The human disease network.PNAS.2007;104(21):8685-8690.

[15]Morrow JK，Tian LZ，Zhang SX.Molecular networks in drug discovery.Critical reviews in biomedical engineering.2010;38(2):143-156.

[16]Zhao SW，Li S.Network-based relating pharmacological and genomic spaces for drug target identification.Plos One.2010;5(7):e11764.

[17]Lu C，Xiao C，Chen G，Jiang M，Zha QL，Yan XP，Kong WP，Lu AP.Cold and heat pattern of rheumatoid arthritis in traditional Chinese medicine:distinct molecular signatures indentified by microarray expression profiles in CD4-positive T cell.Rheumatol Int.2010;doi 10.1007 [Epub ahead of print].

[18]http://sinomed.imicams.ac.cn/index.jsp.

[19]Zheng G，Jiang M，He XJ，Zhao J，Guo HT，Chen G，Zha QL，Lu AP.Discrete derivative:a data slicing algorithm for exploration of sharing biological networks between rheumatoid arthritis and coronary heart disease.BioData Min.2011;4:18.