補腎健脾活血方對大鼠骨質疏松骨折愈合的作用及其機理探討＊

潘貴超，王輝奇，張治國

(1.北京昌平區華一醫院，北京 102208;2.中國中醫科學院望京醫院，北京 100102;3.中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700)

隨著世界人口的老齡化，骨質疏松骨折已成為臨床的常見病、多發病，合并嚴重并發癥，嚴重危害人們的生存質量。中藥治療骨質疏松及骨折歷史悠久，療效確切，是目前治療骨質疏松及骨折的主要手段之一。本研究擬從基因水平探討補腎健脾活血方對骨折愈合的作用及其機理，為采用該方治療骨質疏松骨折提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 動物 本實驗研究對象為清潔級8月齡健康Sprague Dawley(SD)雌性大鼠180只，體重250g～280g，中國醫學科學院實驗動物研究所提供，在天津中醫藥大學動物實驗室飼養，動物許可證號SCXK(京)2005-0013。

1.1.2 主要藥物與試劑 本實驗所用中藥均由北京同仁堂公司提供，中藥方劑委托天津中醫藥大學附屬醫院制劑室制成含生藥5g·ml-1的濃縮口服液，滅菌后裝瓶冷藏備用。陽性對照藥采用貴州同濟堂制藥有限公司生產的仙靈骨葆膠囊，批號20080607。青霉素由華北制藥廠生產，160萬單位，批號 20080204。TGF-βmRNA ISH DIG KIT，復合消化液(T/P/E，Ph6.4)由天津市灝洋生物制品科技有限責任公司提供。DAB顯色試劑盒由福州市邁新生物技術開發有限公司提供。

1.1.3 主要儀器 全自動病理切片包埋機(EG1160)，德國萊卡;圖像分析軟件:ImagePro Plus 5.0。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 麻醉后，去勢組(OVX)進行雙側卵巢切除手術后12周，在腹腔麻醉下行大鼠股骨下端上2cm處切開手術刀切斷術，并行骨圓針逆行穿針術固定。

1.2.2 分組方法 用SPSS軟件產生隨機數字的方法將140只大鼠隨機分為3組:正常組10只和骨質疏松組(OVX)130只。3個月后處死正常組及骨質疏松組各10只，測骨密度觀察模型復制情況。造模成功后再將骨質疏松組120只大鼠分為陽性對照組(仙靈骨葆膠囊)、模型組、補腎健脾活血組，每組40只，每組再隨機分為5個小組，每組8只大鼠。通過觀察補腎健脾活血組與模型組影響TGF-βmRNA表達情況來分析補腎健脾活血治療與模型組TGF-βmRNA表達不同。補腎健脾活血組與陽性藥物組TGF-βmRNA表達陽性比較補腎健脾活血治療與單純補腎治療促進TGF-βmRNA表達不同。

1.2.3 給藥方法 補腎健脾活血中藥藥液按劑量5 g/(kg·d)灌胃，根據大鼠對人等效劑量的2倍每日早晚2次灌胃。陽性藥物對照組給予仙靈骨葆膠囊水溶液灌胃5 g/(kg·d)，空白對照組與模型組給予等量蒸餾水灌胃。所選用實驗用方來源著名骨傷科專家劉柏齡教授經驗方:淫羊藿、熟地、鹿角霜、申姜、肉蓯蓉、敗龜板、生黃芪、鹿銜草、雞血藤、全當歸、川杜仲、漢三七、廣陳皮、淮山藥、鹿角膠(烊化)、萊菔子。

1.2.4 標本處理 術后第 7、14、28、42、56天每個實驗組隨機抽取8只大鼠用拉頸法處死，取出股骨置于質量分數為40g·L－1的多聚甲醛(含1‰DEPC)4℃下固定24 h。取右側股骨標本為研究對象，以骨折為中心取長約10 mm的骨段，將其置于質量分數為 10%的 EDTA-Na2(含 1‰DEPC)脫鈣(每4 d更換1次脫鈣液)。待骨質松軟，針刺及刀割無明顯阻力后表示脫鈣完成。

1.2.5 HE染色 根據HE染色有關試劑的使用說明及該病理科的操作技術規范進行染色。

1.2.6 原位雜交 采用天津市灝洋生物制品科技有限責任公司生產的TGF-β(mRNA)ISH DIG KIT原位雜交試劑盒，對骨折標本 TGF-βmRNA表達進行原位雜交檢查。

1.2.7 圖像分析 以骨折中心在兩斷端附近相同位置對骨折端骨干細胞、骨外膜、骨內膜、血腫、纖維骨痂、軟骨骨痂、骨小梁、小梁間組織及骨髓腔組織各取2個高倍鏡視野。用Imagepro Plus 5.0圖像分析軟件，對這9種組織陽性反應細胞的平均光密度值(MOD)進行分析。

1.2.8 統計學處理 用SPSS13.0統計分析軟件進行統計分析，結果采用均數±標準差表示，檢驗水準:α=0.05。

2 結果

2.1 補腎健脾活血方對骨質疏松骨折大鼠愈合過程組織形態學的影響

骨折后7d，斷端間為血腫及其機化后的纖維素，有單核細胞浸潤。缺損區內可見大量血腫細胞和炎性細胞。骨折后14d:所有標本的外骨膜均增厚，部分標本外骨膜增厚超過4層，少數標本外骨膜成骨細胞顯著增生，增生細胞融合成一片，骨基質沉著，形成類骨質、軟骨及骨小梁;所有標本骨內膜增厚，大部分標本骨髓腔內有新生骨小梁生成，部分標本新生骨小梁充滿骨髓腔。骨折后28d，絕大多數標本骨折斷端成纖維細胞和纖維組織及類骨質增多，所有標本外骨膜成骨細胞顯著增生，增生細胞融合成一片，骨基質沉著，形成骨樣組織、軟骨及骨小梁。骨折56d后，編織骨形成，骨髓腔內的骨小梁變細，骨髓腔再通，編織骨逐漸向板層骨轉變。

2.2 補腎健脾活血方對骨質疏松骨折大鼠愈合過程中TGF-βmRNA表達的影響

術后7 d，補腎健脾活血組、陽性對照組顯著高于模型組(P<0.01)，補腎健脾活血組與陽性對照組無明顯差異。術后14d，補腎健脾活血組與陽性對照組有顯著差異(P<0.05)。術后28d，補腎健脾活血組與模型組有顯著差異(P<0.01)，補腎健脾活血組顯著高于陽性對照組(P<0.05)。術后42d，補腎健脾活血組與模型組有顯著差異(P<0.05)，其他各組無差別。術后56d，補腎健脾活血組、陽性對照組顯著高于模型組(P<0.01)，補腎健脾活血組與陽性對照組有顯著差異(P<0.05);各組總平均值:補腎健脾活血組極顯著高于模型組，陽性對照組極顯著高于模型組(P<0.01)。

表 模型組、陽性對照組及補腎健脾活血組骨折愈合過程中TGF-βmRNA表達MOD值變化

表 模型組、陽性對照組及補腎健脾活血組骨折愈合過程中TGF-βmRNA表達MOD值變化

注:與模型組比較:*P<0.05，＊＊P<0.01;與陽性對照組比較:＆P<0.05，＆＆P<0.01

天 數 模型組 陽性對照組 補腎健脾活血組0.204±0.015 0.220±0.008＊＊ 0.225±0.011＊＊第 7天第14天 0.206±0.010 0.218±0.007* 0.233±0.009＊＊＆第28天 0.220±0.01 0.228±0.010 0.241±0.004＊＊＆第42天 0.219±0.010 0.229±0.008 0.229±0.006*第56天 0.203±0.009 0.225±0.007＊＊ 0.235±0.010＊＊＆平 均 值 0.210±0.013 0.224±0.009＊＊ 0.233±0.010＊＊＆＆

3 討論

中醫學無“骨質疏松癥”這一病名，但歷代中醫文獻的記載中“骨痿”、“骨枯”、“骨痹”的描述與OP的臨床癥狀頗似。中醫學認為，腎虛是本病的主要病因，脾虛是本病的重要病機，肝血不足、氣滯血瘀是本病的促進因素，所選用實驗用方來源于著名骨傷科專家劉柏齡教授經驗方。補腎健脾活血法以“腎主骨”理論為指導，針對骨質疏松癥“多虛多瘀”的病機特點，以申姜、肉蓯蓉補腎壯骨為主，輔之鹿角膠、淫羊藿、川杜仲補腎益精、強筋骨為臣，同時配以黃芪補中益氣，當歸、雞血藤、三七活血止痛，廣陳皮、淮山藥、熟地、敗龜板滋陰益氣共為佐藥，此既培補后天生化之源以充腎精，又達到補中寓通、補而不滯的目的。本方具有補腎壯骨、活血通絡、健脾益氣滋陰的作用，組方上既強調補益又突出調節，補腎的同時注重祛瘀，體現出中醫學治療疾病的整體觀念和“標本兼治”的思想。

現代醫學研究證實，骨折愈合的實質是骨細胞再生，骨折完全性修復，其整個過程受局部骨生長因子的調控。大量實驗及臨床研究初步證實，骨折局部骨細胞生長因子對于成骨的誘導、細胞的分裂增殖、細胞的分化成熟、骨基質的合成與軟骨內化骨及局部血液循環的重建等起著極其重要的作用，調控著骨折的再生修復過程。TGF-β可促進骨膜間充質細胞的增殖和分化，促進成骨細胞的增殖，刺激Ⅱ型膠原、骨連接素和骨橋蛋白的合成，同時 TGF-β可抑制破骨細胞的生成以及成熟破骨細胞的活性，從而抑制骨吸收的作用，所以TGF-β在骨組織代謝過程中起著十分重要的作用[1～3]。

骨折后7 d，斷端間為血腫及其機化后的纖維素有單核細胞浸潤，缺損區內聚集大量血腫細胞和炎性細胞。骨折后14d，所有標本的外骨膜均增厚，可見大量間充質細胞、成骨細胞與新形成的骨細胞。骨折后28d，絕大多數標本骨折斷端成纖維細胞和纖維組織及類骨質增多，所有標本外骨膜成骨細胞顯著增生，增生細胞融合成一片，骨基質沉著，形成骨樣組織、軟骨及骨小梁，在成纖維細胞、成軟骨細胞、軟骨細胞、成骨細胞、骨細胞等表達陽性。補腎健脾活血方主要促進了大鼠骨折愈合過程中軟骨骨痂向骨性骨痂轉化，提高了骨的強度，促進了骨折愈合。

從骨折愈合整個時間點看，骨折后7d～56d，補腎健脾活血組極顯著高于模型組和陽性對照組，陽性對照組極顯著高于模型組，說明從骨轉化和成纖維方面說明補腎健脾活血組能促進斷端TGF-βmRNA表達的作用最強，顯著提高TGF-βmRNA表達峰值水平。通過與陽性藥物組對比，說明根據骨質疏松的病機辨證組方比單純補腎更能顯著提高TGF-βmRNA表達峰值水平，說明通過促進斷端成纖維細胞、成骨細胞等 TGF-βmRNA表達可能是中藥促進骨質疏松性骨折愈合的機制之一。補腎健脾活血方治療效果最好，說明辨證治療是必要的。

[1]孫玉鵬，胡蘊玉.β轉化生長因子研究進展[J].中華骨科雜志，2007，14:505.

[2]孫玉鵬，陸裕補，胡蘊玉，等.TGF-β提取純化及其誘導小鼠股骨成骨作用[J].中華骨科雜志，1995，15:610.

[3]Centrella M， Skeletaltissueand transforming growth factor FASEBI[J]，2008，2(1)3066-3073.