柚皮素對炎性氣道黏液高分泌的抑制作用

楊 娟，周向東

(重慶醫科大學第二附屬醫院呼吸內科，重慶 400010)

氣道黏液高分泌是慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管擴張癥等慢性炎癥性疾病的重要臨床病理特征，也已成為影響COPD病情和預后的獨立危險因素[1]。氧化應激是啟動和加重炎癥反應的重要因素，其主要物質活性氧(ROS)已被證實是一種強化學介質，能作用于細胞膜的受體激酶，調節多種信號轉導途徑，并參與黏液高分泌過程[2]，但具體途徑尚未完全明了。表皮生長因子受體(EGFR)作為一種酪氨酸激酶受體，與氣道黏蛋白的表達有密切聯系[3]。有研究指出，過量的 ROS可上調 EGFR的表達水平和增加其磷酸化水平，調控EGFR信號級聯及后續細胞分子效應[4]。柚皮素是一種廣泛用于植物和中藥中的黃酮類化合物，國外研究證實，除具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤及降血脂的作用，還具有較強的抗氧化瘤及降血脂的作用，還具有較強的抗氧化作用，能作用于細胞信號轉導途徑并發揮其生物學效應。本研究旨在探討柚皮素對黏液高分泌的影響及其在ROS/EGFR細胞信號通路中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 柚皮素純度大于95%購于美國sigma公司，取其粉末溶解于20%的二甲基亞砜中，加不含血清的培養液稀釋為 400mmol/L，采用0.02μm微孔過濾器除菌、分裝，濾器除菌、分裝，避光－20℃冰箱保存，2個月內有效，使用前以培養液稀釋至所需濃度(100μmol/L)，二甲亞砜的終濃度<0.1%。

1.1.2 細胞來源 人肺上皮細胞株A549(中國科學院上海細胞研究所)培養于含10%小牛血清、雙抗(青霉素 100U/ml、鏈霉素 100U/ml)的RPMI1640培養基中，置37℃ 5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，0.25%胰酶消化傳代，每2d傳代1次并隨時觀察細胞形態。

1.1.3 主要試劑 人中性粒細胞彈性蛋白酶(HNE)購自美國 EPC公司，Triton-X100為美國sigma公司，活性氧清除劑 DMTU購自美國Calbiochem公司，小鼠抗人黏蛋白(MUC)5AC單克隆抗體為美國Chemicon公司，兔抗EGFR多克隆抗體、小鼠抗磷酸化EGFR(P-EGFR)單克隆抗體為美國Cell Signaling公司，異硫氰酸(FITC)標記的羊抗鼠熒光素IgG、辣根酶標記羊抗兔 IgG、辣根酶標記的羊抗鼠IgG為北京中衫金橋生物技術有限公司，RNA抽提試劑盒、逆轉錄(RT)-PCR試劑盒為大連寶生物工程有限公司，MUC5AC、EGFR、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物由上海生物有限公司合成，活性氧試劑盒、免疫細胞沉淀裂解液為碧云天生物技術研究所，其余試劑為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞活性測定 將細胞接種于96孔板，每孔200μl細胞懸液中含1×104個細胞，培養24h后換無血清培養液維持24h，分別加入濃度為0、20、50、80、100、200、400μmol/L 的柚皮素，作用24h后行甲基偶氮唑鹽(MTT)法測定，酶標讀數儀上以492nm波長測定各孔吸光度(A)值。不加柚皮素只加等量二甲基亞砜孔為陰性對照，無細胞僅加培養液孔為空白對照。各實驗組安排6個復孔取平均值，細胞存活率=(實驗組值A值－空白對照組A值)/(陰性對照組 A值 －空白對照組 A值)×100%。實驗重復3次，結果基本一致，以其中1次實驗值為準，繪制細胞生存圖。

1.2.2 細胞處理及分組 細胞貼壁融合達70%～80%時傳代培養。用于RT-PCR檢測的細胞組接種于6孔板，每孔接種4×105個細胞，用于提取蛋白的接種于50ml培養瓶，每瓶接種20×105個細胞。當細胞融合約為70%時更換無血清培養基(用0.1%牛血清白蛋白代替血清)繼續培養24h，以維持基礎濃度的黏蛋白表達。分組:(1)對照組:無血清培養基培養;(2)處理組:無血清培養基中加入終濃度為50nmol/L的HNE;(3)柚皮素組:加入終濃度為100μmol/L的柚皮素，作用24h后再給予終濃度為50nmol/L的 HNE刺激;(4)DMTU組:先給予20μmol/L的DMTU處理，30min后，再給予終濃度為50nmol/L的HNE刺激;(5)柚皮素+DMTU組:先加柚皮素100μmol/L作用24h后，再給予20μmol/L的DMTU處理30min后，最后給予終濃度為50nmol/L的HNE刺激。各組處理24h內取樣實驗。

1.2.3 細胞中ROS含量的測定 處于對數生長期的A549細胞以無血清培養基維持24 h，洗滌換液，分別加入終濃度5nmol/L、25nmol/L、50nmol/L HNE和100μmol/L柚皮素無血清培養液孵育，對照組僅以無血清培養液維持培養。24h后測定各組細胞中ROS的相對含量，按試劑盒操作說明進行活性氧的測定，結果以吸光度A值表示。

1.2.4 RT-PCR檢測EGFR mRNA和MUC5AC mRNA的表達水平 分別提取各組細胞的總RNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并測定樣品A260/A280比值和濃度，確保比值介于1.8～2.0，總RNA提取后保存于－80℃冰箱，并于數日內盡快使用。

兩步法進行RT-PCR。擴增引物序列:EGFR上游引物5′-CTC-ACG-CAG-TTG-GGC-ACT-TT-3′，EGFR 下游引物:5′-TCA-TGG-GCA-GCT-CCT-TCAGT-3′，擴增長度為 301bp;MUC5AC 上游引物:5′-TCA-ACG-GAG-ACT-GCG-AGT-ACA-C-3′，下 游 引物:5′-TCT-TGA-TGG-CCT-TGG-AGC-A-3′，擴增長度為 135bp;逆轉錄反應條件為 30℃、10min，42℃30min，95℃ 5min，5℃ 5min，以上步驟 1 個循環。MUC5AC+EGFR的PCR反應條件為:于94℃預變性2min終止后，緊隨30個循環，循環參數:94℃變性 30s，59℃ 退火 30s，72℃ 延伸 1.5min，后 72℃延伸5min補齊末端。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，圖像采集后用Bandleader軟件進行吸光度面積積分分析，以與GAPDH mRNA的比值作為目的基因mRNA的相對含量。

1.2.5 Western blot法檢測各目標蛋白的表達

使用細胞裂解液冰上操作，提取各組培養瓶的總蛋白后加入5倍十二烷基硫酸鈉(SDS)，經高溫加熱使蛋白完全變性、解聚，－80℃冰箱保存備用。各樣品上樣量為30μl，8%或12%SDS-PAGE凝膠恒壓電泳，濃縮膠80V，分離膠100V，給予聚偏二氟乙烯膜轉膜，恒流250mA轉膜，EGFR和P-EGFR轉膜1h 50min，脫脂奶粉封閉 1h，加入一抗 4℃孵育過夜，一抗:1∶200的小鼠抗 P-EGFR單克隆抗體、兔抗EGFR多克隆抗體;PBST洗膜15min，加入二抗孵育1h，二抗1∶2000的辣根酶標記羊抗兔 IgG，辣根酶標記的羊抗鼠 IgG。用增敏化學發光法顯影后，目標條帶經吸光度面積積分析，以與 β-肌動蛋白產物條帶的比值作為相對含量。

1.2.6 激光共聚焦顯微鏡觀察不同條件下MUC5AC蛋白表達的變化 將對數生長期A549細胞消化后，接種于載有蓋玻片的24孔培養板中，每孔接種1×105個細胞，24h后更換無血清培養基，培養24h后再分組培養。細胞培養結束后吸棄培養液，用0.01mmol/L的PBS漂洗，用4%多聚甲醛在室溫下固定30min，用0.4%Triton-X100在室溫下作用20min，加入羊血清工作液在室溫下封閉30min;去血清加入一抗(小鼠抗人MUC5AC單克隆抗體1∶500)置濕盒內4℃過夜，0.01mmol/L的 PBS漂洗;加二抗(FITC標記的羊抗鼠IgG1∶100)，置濕盒內室溫下 2h，0.01mmol/L的 PBS漂洗，滴加5mg/L碘化丙錠，室溫下5min 50%甘油封片;未加一抗僅加二抗者作為陰性對照，激光共聚焦顯微鏡觀察并成像。

1.2.7 酶聯免疫吸附法測定細胞裂解液中MUC5AC蛋白含量 培養瓶內細胞在冰上用0.01mmol/L的PBS清洗，加入冰預冷的RIPA裂解液及相應1/100量的苯甲基磺酰氟化物，晃動、吹打后吸入 EP管中冰浴 20min，4℃ 15000r/min離心20min，留上清液。取各樣本少許采用二喹啉甲酸法測定總蛋白含量，用RIPA裂解液調整蛋白濃度使各樣本一致，再用 PBS稀釋蛋白樣本。取各樣本100μl包被96孔酶標板，置濕盒中4℃過夜。次日棄包被液，扣干后每孔加入200μl的1%牛血清白蛋白，于濕盒中37℃封閉1h。洗板后每孔加入1∶1000小鼠抗人 MUC5AC單克隆抗體 50μl，37℃孵育1h。洗板后扣干，四甲基聯苯胺過氧化物酶溶液顯色，終止反應后測各孔在450nm處 A值，與標準品比較計算MUC5AC含量。

1.3 統計學處理

應用SPSS 13.0軟件包對結果進行統計學分析，所有數據均以±s表示，兩樣本均數間比較采用t檢驗，多樣本均數間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞活性測定結果

柚皮素濃度分別為 0、20、50、80、100、200 和400μmol/L時，細胞生存率分別為100% ±1.0%、98.2% ±0.2%、92.9% ±0.7%、84.6% ±0.3%和81.6% ±0.6%，表明柚皮素濃度低于 100μmol/L時對細胞無明顯損傷，隨著濃度遞增，當柚皮素濃度達200μmol/L和400μmol/L時細胞貼壁能力降低，死亡細胞增多，細胞生存率分別為45.0% ±0.8%和25.4%±0.7%。

2.2 細胞中ROS的相對含量

在5nmol/L、25nmol/L和50nmol/L的HNE刺激后的細胞中，ROS的相對含量分別為0.68±0.02、0.81±0.07和 0.98±0.08，說明隨著 HNE 濃度增加，ROS的含量逐漸增加，與對照組(0.39±0.06)比較，t值分別為 11.19、11.20和 11.43，50nmol/L的HNE和柚皮素預處理組(0.57±0.04)比較t值為11.23，均P<0.01，差異均有統計意義，且表明柚皮素具有抑制細胞內ROS產生的作用。

2.3 各組指標mRNA及蛋白的表達

表1顯示，MUC5AC、EGFRmRNA和 EGFR、PEGFR蛋白的表達吸光度面積積分值。

表1 各組指標mRNA和蛋白表達的吸光度面積積分值比較

表1 各組指標mRNA和蛋白表達的吸光度面積積分值比較

注:HNE:人中性粒細胞彈性蛋白酶;DMTU:活性氧清除劑;MUC5AC:黏蛋白5AC;EGFR:表皮生長因子受體。▲以MUC5AC/總蛋白(μg/mg)表示。與對照組比較:＊＊P<0.01;與HNE組比較:△△P<0.01;與柚皮素組和DMTU組比較:##P<0.05

組 別n mRNA蛋白MUC5AC EGFR MUC5AC▲EGFR P-EGFR對照組 3 0.70±0.02 0.73±0.01 112±4 0.39±0.03 0.38±0.02 HNE 3 0.92 ±0.08＊＊ 0.91 ±0.05＊＊ 152 ±6＊＊ 0.86 ±0.03＊＊ 0.93 ±0.05＊＊柚皮素 3 0.57±0.09△△ 0.54±0.07△△ 125±6△△ 0.52±0.05△△ 0.61±0.01△△DMTU 3 0.62±0.06△△ 0.63±0.03△△ 128±4△△ 0.53±0.02△△ 0.74±0.05△△柚皮素 +DMTU 3 0.34±0.04## 0.38±0.03## 113±2## 0.42±0.02## 0.41±0.03##

表1顯示，與對照組相比，給予 HNE刺激后MUC5AC mRNA、EGFR mRNA 和 EGFR、P-EGFR 蛋白表達增強(P<0.01)，而給予柚皮素和 DMTU預處理后表達減弱，柚皮素組與 HNE組比較 P<0.01;DMTU組與 HNE組比較 P<0.01;柚皮素 +DMTU組分別與柚皮素組和DMTU組比較，以上指標表達進一步降低(P<0.05)。

2.4 HNE刺激前后和柚皮素預處理后A549細胞MUC5AC的激光共聚焦顯像

經異硫氰酸熒光素/碘化丙錠染色的高倍放大鏡結果顯示，圖A中未加一抗的陰性對照組A549細胞僅可見呈紅色顯色少量的 MUC5AC;圖 B中A549細胞的MUC5AC蛋白主要定位于細胞質，呈綠色顯色;圖 C中 A549細胞經 HNE處理后MUC5AC的表達較 A549細胞明顯增多;圖 D中經柚皮素處理后A549細胞在胞質的表達減少。

圖1 A549細胞黏蛋白表達(激光共聚焦顯微鏡×400)

3 討論

黏液高分泌是影響慢性氣道炎癥發生、發展及預后的重要因素。目前認為，HNE除了是參與急性肺損傷的主要因素外，還是黏蛋白表達的最強誘導物，也是炎癥反應時氣道黏液高分泌形成過程的主要刺激因子，而MUC5AC則為炎癥反應氣道黏蛋白的主要特征性表型，并決定著高分泌黏液的病理特征[5]。

EGFR通過配體依賴和非配體依賴機制而自身磷酸化，引發下游信號級聯反應，并傳遞至細胞核而活化相應的順式反應元件，啟動黏蛋白合成。有研究表明，多種刺激因子均可借配體依賴途徑激活EGFR信號級聯通路引起黏蛋白合成增加[6]。氣道炎癥時出現中性粒細胞大量聚集，可釋放HNE并刺激局部釋放多量ROS。以往的研究提示，ROS可通過激活 EGFR的配體釋放而間接激活 EGFR[7];而最近的研究也表明，ROS還可通過非配體依賴機制直接反相激活EGFR。通過減少EGFR表達和活化的刺激來抑制黏液高分泌，可能是治療氣道黏液高分泌的有效靶點，而ROS由于兼具雙重刺激機制成為重要靶目標。

柚皮素是柚油的主要成分，主要來源于未成熟的柚子皮，具有抑制氧化產物的產生和增強抗氧化物酶活性的作用[8]。本研究首先以 HNE為刺激因素，檢驗其是否可誘導人肺腺癌細胞A549產生大量的ROS，引起EGFR磷酸化水平增高，上調氣道上皮細胞黏蛋白的表達。結果表明，A549細胞經HNE處理后，細胞內 ROS含量增加，其 MUC5AC mRNA及MUC5AC蛋白含量也增加，且EGFR和PEGFR也明顯增加，說明黏蛋白的增加與 EGFR的活化呈正相關，這與MUC5AC合成受EGFR信號通路調控的研究結果一致。當給予柚皮素干預后，通過活性氧試劑盒測定人 A549細胞內ROS水平降低，RT-PCR測定 EGFR mRNA和 MUC5AC mRNA均較HNE刺激組明顯下調。Western blot法檢測結果表明，相應的EGFR和P-EGFR蛋白表達明顯降低;細胞免疫組織化學結果也表明，經柚皮素預處理后MUC5AC蛋白表達減少;激光共聚焦觀察結果也顯示，柚皮素處理后A549細胞質中 MUC5AC蛋白表達減弱，提示柚皮素可抑制 ROS的產生而引起EGFR的表達下調及其磷酸化水平降低來減少黏蛋白的轉錄和合成。此外還觀察到，柚皮素+DMTU組EGFR mRNA和其蛋白以及MUC5AC的表達比單用DMTU組要低，提示柚皮素可通過直接降低EGFR膜受體水平和阻斷EGFR磷酸化來進一步降低黏蛋白的轉錄和合成。本實驗結果證實，柚皮素對黏液高分泌的主要發生途徑有明顯的抑制作用，這為柚皮素的藥用開發提供了理論依據。

綜上所述，柚皮素可明顯改善炎性刺激所致的氣道黏液高分泌狀態，其機制主要系通過抑制ROS的產生、降低EGFR膜受體水平和阻斷EGFR磷酸化來實現的。柚皮素這一效應，顯示了對肺部炎性疾病發生、發展的有益作用，加之其資源豐富、成本低廉，具有一定的開發價值。

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