抗纖益心方對擴張型心肌病大鼠心肌基質(zhì)金屬蛋白酶-3及其抑制劑-3表達的影響＊

王振濤，韓麗華，楊鳳鳴，惠 玲

(1.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450011;2.南陽市中醫(yī)院，河南 南陽 473007)

擴張型心肌病的心室重構(gòu)是該病發(fā)展的重要病理環(huán)節(jié)。心肌細胞和細胞外基質(zhì)(Extracellular matrixc，ECM)的變化是心室重構(gòu)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。心肌細胞外基質(zhì)時刻處于一個動態(tài)的合成－降解過程中，一旦動態(tài)平衡被打破，膠原網(wǎng)絡(luò)發(fā)生重建，必將導(dǎo)致心室重構(gòu)[1]。其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetallo-Proteinases，MMP)與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(tissueinhibitorsofmetal-loproteinase，TIMP)的調(diào)節(jié)對心肌細胞外基質(zhì)起重要的作用[2]。本研究觀察抗纖益心方對擴張型心肌病大鼠心肌ECM的影響，并通過觀察擴張型心肌病大鼠心肌基質(zhì)金屬蛋白酶-3(Matrix metalloproteinase-3，MMP-3)及其抑制因子-3(Tissueinhibitorsof metalloproteinase-3，TIMP-3)表達水平的變化并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 用藥

抗纖益心方干浸膏由黨參、黃芪、云苓、白術(shù)、丹參、川芎、紅花、赤芍、澤蘭、益母草組成，由河南省中醫(yī)院制劑室提供，每克干浸膏相當(dāng)于生藥4g;呋喃唑酮片由福建省三明天泰制藥有限公司生產(chǎn)，批號20050204;卡托普利片由常州制藥廠生產(chǎn)，批號200502242;戊巴比妥鈉為中國醫(yī)藥(集團)上海化學(xué)試劑公司生產(chǎn)，批號F20021216。

1.1.2 試劑

MMP-3多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-0413R;TIMP-3多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-0417R;兔兩步法二抗:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，PV-6001;DAB顯色試劑盒:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZLI-9032。

1.1.3 器材 JY-1001型精密電子天平(上海民橋電子儀器廠);石蠟切片機(德國萊卡公司，型號SM-2000R);光學(xué)顯微鏡(日本 OLYMPUS公司);攝影顯微鏡(德國萊卡公司);Image-Pro Plus 6.0(IPP)圖像處理分析系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司)。

1.2 動物造模及分組

選取體重為 61.9g±7.0g的 Wistar雄性大鼠(鄭州大學(xué)動物中心提供，合格證號510116。把動物按5∶1隨機分為模型組和正常對照組。參照文獻方法[3]，模型組在飲水中加呋喃唑酮(按1kg水加700mg呋喃唑酮配置)喂養(yǎng)8周。正常組動物常規(guī)飼養(yǎng)，不進行藥物干預(yù)。

1.3 治療方法

造模8周后開始藥物干預(yù)，每天1次給藥。模型組動物每日管飼與治療組同等容積的生理鹽水;抗纖益心方小劑量組(中藥小劑量組)動物每日管飼抗纖益心方4.7g/(kg·d);抗纖益心方大劑量組(中藥大劑量組)動物每日管飼抗纖益心方18.8g/(kg·d);卡托普利對照組動物每日管飼卡托普利10.125mg/(kg·d);卡托普利與抗纖益心方大劑量合用組(中西藥聯(lián)用組)動物同時管飼卡托普利及抗纖益心方大劑量。灌藥同時所有擴張型心肌病造模大鼠同時繼續(xù)飲用呋喃唑酮水溶液。藥物干預(yù)8周后處死動物。正常組動物每日管飼與治療組同等容積的生理鹽水。

1.4 心肌取材

藥物干預(yù)8周后麻醉動物，迅速打開胸腔取出心臟，濾紙吸干水分，剪去左、右心房及右心室，然后從心尖處沿冠狀面切取左心室心肌組織，放入10%中性緩沖福爾馬林液中固定，石蠟包埋，制備厚4μm組織切片。

1.5 免疫組化染色方法

MMP-3、TIMP-3陽性表達檢測均采用免疫組化法。二甲苯脫蠟(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)各15min，降濃度梯度100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇脫二甲苯各5min，水洗2min，蒸餾水沖洗2min×3次，PBS漂洗2min×3次，微波抗原修復(fù)，高火加熱至枸櫞酸緩沖液沸騰后改低火加熱15min，自然冷卻后PBS漂洗2min×3次，滴加50ul 3%H2O2，孵育10min，滅活組織內(nèi)源性抗原，PBS漂洗2min×3次，滴加50ul MMP-3或TIMP-3抗體(1∶100稀釋)，4℃過夜，次日濕盒恢復(fù)至室溫，PBS漂洗2min×3次，滴加 50ul二抗 PV-6001，37℃ 孵育30min，PBS 漂洗2min×3次，DAB顯色8min，自來水沖洗終止反應(yīng)，乙醇升梯度70%、80%、90%、95%、100%，脫水各 5min，二甲苯(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)透明各 15min，中性樹膠封片。

1.6 指標檢測方法

MMP-3、TIMP-3平均光密度值(OD)的測定:光鏡下，每只大鼠觀察6張切片，每張切片在圖像分析系統(tǒng)上隨機選取相等的5個高倍視野(×400)測定OD值，每張片子測量后取平均值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

圖1、2顯示，光鏡下各組 MMP-3和 TIMP-3的陽性染色呈棕黃色或棕褐色，陽性區(qū)域主要分布于心肌間質(zhì)。

圖1 左室心肌組織MMP-3免疫組化染色照片(×400)

圖2 左室心肌組織TIMP-3免疫組化染色照片(×400)

2.1 各組MMP-3比較

與模型組比較，中藥大劑量組、中藥小劑量組、卡托普利組、中西藥聯(lián)用組 MMP-3陽性表達減少(P<0.05)，其中以中西藥聯(lián)用組作用最強。

2.2 各組TIMP-3比較

與模型組比較，中藥大劑量組、中藥小劑量組、卡托普利組、中西藥聯(lián)用組TIMP-3陽性表達增加(P<0.05)，其中仍以中西藥聯(lián)用組作用最強。

3 討論

心室重構(gòu)是擴張型心肌病發(fā)生、發(fā)展的基本病理環(huán)節(jié)，而ECM重構(gòu)(間質(zhì)成纖維細胞的增生及其合成的心肌膠原含量的增加)是心室重構(gòu)的重要組成部分。心肌細胞間質(zhì)時刻處于一個動態(tài)的合成-降解過程中，一旦動態(tài)平衡被打破，膠原網(wǎng)絡(luò)發(fā)生重建，必將導(dǎo)致心室重構(gòu)[1]。

MMPS的異常參與了許多心血管疾病的發(fā)病過程，MMPS的表達和活性過度增強或 MMPS/TIMPS比例失調(diào)導(dǎo)致正常的心肌膠原蛋白過度降解，并被缺乏連接結(jié)構(gòu)的纖維性間質(zhì)取代，使心肌膠原重構(gòu)，引起心腔擴大、室壁變薄導(dǎo)致心功能惡化[4]。MMP-3是MMPS中的1種，除了能降解膠原，還能降解基底膜成分，廣泛存在于多種組織和細胞中，其獨特的功能是能夠激活其他種類的 MMPS[5]，從而啟動膠原增殖反應(yīng)。TIMP-3是TIMPs家族中的重要成員，具有與其他TIMPs成員不同的特性，它只存在于細胞外基質(zhì)中，是一種結(jié)合于細胞外基質(zhì)的非可溶性蛋白[6]。DCM心肌中存在 MMP/TIMP的平衡及活性受到破壞，必然導(dǎo)致基質(zhì)膠原代謝紊亂，心肌細胞外膠原積聚，最終導(dǎo)致心臟重構(gòu)[7]。

表各組MMP-3、TIMP-3 OD值結(jié)果比較

表各組MMP-3、TIMP-3 OD值結(jié)果比較

注:與正常組比較:*P<0.05;與模型組比較:△P<0.05

別 n MMP-3 OD值 TIMP-3 OD 值 常 組 6 0.1670±0.0107△ 0.9052±0.068 型 組 6 0.2480±0.0116* 0.5183±0.036組正6△模9*卡托普利組 6 0.1812±0.0106△ 0.7540±0.0409＊△中藥大劑量組 5 0.1758±0.0075＊△ 0.7482±0.0386＊△中藥小劑量組 6 0.2067±0.0100＊△ 0.6137±0.0624＊△中西藥聯(lián)用組 6 0.1751±0.0122△ 0.8581±0.0537△

本研究測定實驗性擴張型心肌病大鼠MMP-3及TIMP-3陽性表達發(fā)現(xiàn)，抗纖益心方大劑量有同對照西藥卡托普利相同的降低MMP-3和升高TIMP-3的作用，且抗纖益心方大劑量與卡托普利合用組作用更明顯，表明兩藥合用可能對抑制心肌纖維化有協(xié)同作用。而小劑量抗纖益心方對擴張型心肌病大鼠MMP-3和TIMP-3的作用與大劑量抗纖益心方的作用比較也有差異，表明抗纖益心方抑制擴張型心肌病大鼠心肌纖維化的作用隨其劑量的增加而增強。

[1]Spinale FG，Coker ML，Bond BR，et al.Myocardial matrix degradation and metaloproteinase activation in the failing heart:a potential therapeutic target[J].Cardiovasc Res，2000，46(2):225-238.

[2]王麗萍，楊方.基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子與心肌纖維化[J].中國動脈硬化雜志，2005，4(13):517-519.

[3]黃榮杰，劉唐威，伍偉鋒，等.呋喃唑酮制備大鼠擴張型心肌病模型[J].中國病理生理雜志，2003，23(10):2147-2150.

[4]覃遠漢，劉唐威，伍偉鋒，等.MMP-3、TIMP-1在病毒性心肌炎中的表達及其與心肌膠原的關(guān)系[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2005，22(2):182-185.

[5]Thomas CV，Coker ML，Zellner JL，et al.Increased matrix metalloproteinase activity and selective up regulation in LV myocardium from patients with end-stage dilated car diomyopathy[J].Circulation，1998，97(17):1708-1715.

[6]呂國麗，文劍明.金屬蛋白酶組織抑制因子-3的結(jié)構(gòu)、表達調(diào)控和生物學(xué)功能[J].國外醫(yī)學(xué)·生理、病理科學(xué)與臨床分冊，2003，2(1):53-56.

[7]WoodiwissAJ，TsotetsiOJ，SprottS，etal.Reduction in myocardial collagen crosslinking parallels left ventricular dilation in rat models of systolic chamber dysfunction[J].Circulation，2001，103:155-160.