化痰與活血基礎(chǔ)方對非酒精性脂肪肝大鼠TNF-α、IL-6影響的實(shí)驗(yàn)研究

袁 夢，車念聰，趙 暉，夏 蓉，季巍巍，法振鵬

(首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcohol fatty liver disease，NAFLD)是一種肝組織學(xué)改變與酒精性肝病(ALD)相類似但無過量飲酒史的臨床病理綜合征，由遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)因素所致。其發(fā)病機(jī)制尚不明確，較為流行的是Day et al[1]提出的“二次打擊”學(xué)說，初次打擊主要為胰島素抵抗(insulin resistance，IR)促使肝臟甘油三酯(triglyeride，TG)蓄積，導(dǎo)致肝細(xì)胞對內(nèi)外源性損害因子的敏感性增強(qiáng)。而炎癥因子產(chǎn)生，游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)增多，肝細(xì)胞內(nèi) TG氧化增多，肝細(xì)胞能量儲備不足，內(nèi)毒素、鐵蓄積等因素則通過誘發(fā)氧化應(yīng)激導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化損傷，對肝臟進(jìn)行第二次打擊。除非能及時阻止炎癥壞死循環(huán)，否則將進(jìn)展為肝纖維化和肝硬化[2、3]。NAFLD在中醫(yī)學(xué)中多以痰瘀互結(jié)作為基本病機(jī)[4]，痰和瘀是其發(fā)病的關(guān)鍵要素。根據(jù)這一理論，本課題組選用化痰基礎(chǔ)方二陳湯及活血基礎(chǔ)方桃紅四物湯對NAFLD模型大鼠進(jìn)行治療。前期的研究表明，上述兩方在不同階段對IR抵抗有一定程度的改善作用[5]，而其具體作用機(jī)制尚不明確。為進(jìn)一步探討NAFLD發(fā)病機(jī)理，以及二陳湯和桃紅四物湯的作用靶點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)定性及定量地對肝組織中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)及白介素-6(interleukin6，IL-6)的表達(dá)進(jìn)行觀察和測定，為臨床防治NAFLD提供客觀依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料

SD大鼠72只，SPF級，初始體質(zhì)量180g±10g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)技術(shù)有限公司;高脂飼料配方:10%豬油+2%膽固醇+0.5%膽酸鈉+5%蛋黃粉+普通飼料至100g:北京科澳協(xié)力飼料加工有限公司;中藥飲片為北京同仁堂藥業(yè)股份有限公司;羅格列酮為葛蘭素史克公司產(chǎn)品;二甲雙胍為中美上海施貴寶公司;四氯化碳溶液為北京化學(xué)試劑公司;兔抗TNF-α、IL-6抗體為北京博奧森生物技術(shù)有限公司;兔超敏二步法免疫組化檢測試劑為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;大鼠TNF-a、IL-6酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，ENDOGEN(美國)公司;紫外分光光度計:UV-1700，日本島津;低溫離心機(jī):Biofuge15R，Heraeus sepatech德國;電子分析天平:JA-1003，上海精科天平廠;電動玻璃勻漿機(jī):DY89-1，寧波新芝生物科技股份有限公司;恒溫水浴鍋為天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司;渦旋混勻器:WH-861，北京科爾德科貿(mào)有限公司;Labofuge 400R低溫離心機(jī)為德國 Heraeus;酶標(biāo)儀:Multiskan MK3型，芬蘭 Thermo BioAnalysis Company。

1.2 方劑制備及給藥量

二陳湯和桃紅四物湯劑量參考上海科學(xué)技術(shù)出版社1998年第6版《方劑學(xué)》。二陳湯:橘紅15 g，半夏15 g，茯苓9 g，甘草5 g;桃紅四物湯:川芎6 g，赤芍 6g，當(dāng)歸 9g，紅花 9g，熟地 9g，桃仁 12g。各方按處方比例購置藥材，傳統(tǒng)方法煎煮中藥。蒸餾水溶解羅格列酮片劑及二甲雙胍片劑，制備羅格列酮0.30mg/ml、二甲雙胍30mg/ml溶液。西藥對照組按羅格列酮1.5mg/kg·d聯(lián)合二甲雙胍150mg/kg·d的給藥量，治療組按二陳湯7.5g/(kg·d)、桃紅四物湯8.5g/(kg·d)的量給動物灌服(相當(dāng)于人體正常用量的10倍)，正常組和模型組以1ml/100g體重的標(biāo)準(zhǔn)灌服蒸餾水，每天1次至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3 動物模型復(fù)制

同批次健康成年雄性SD大鼠72只，SPF級，初始體重180g±10g，適應(yīng)性喂養(yǎng)5d后，按體重區(qū)組分層隨機(jī)分為空白對照組12只，模型組、西藥對照組、二陳湯組、桃紅四物湯組各15只。參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行模型復(fù)制:模型組和3個藥物組以高脂飼料飼養(yǎng)，從第5周起按0.2 mL/100g體重的標(biāo)準(zhǔn)給予40%四氯化碳豆油溶液，從大鼠背部后側(cè)皮下注射每周2次，共3周。空白對照組始終喂以普通飼料。飼養(yǎng)期間，模型組死亡2只大鼠。從造模開始，二陳湯組和桃紅四物湯組即分別灌服二陳湯、桃紅四物湯，西藥對照組灌服羅格列酮與二甲雙胍混合溶液，模型組和空白對照組灌服蒸餾水。

1.4 動物采樣及樣本處理

第8周末動物飼養(yǎng)結(jié)束，大鼠斷頭采血處死，迅速取出肝臟，觀察肝臟顏色質(zhì)地特征，取1cm×3cm肝組織以10%甲醛固定，脫水、石蠟包埋固定、切片、HE染色，光鏡下觀察肝臟病理學(xué)改變，剩余肝組織－80℃凍存。

1.5 病理切片處理

1.5.1 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟、復(fù)水，TNF-α采用微波修復(fù)法，IL-6采用胰酶修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過氧化氫溶液浸染切片10min阻斷生物酶，PBS緩沖液清洗后入一抗(1∶100稀釋)，4℃冰箱過夜。取出后室溫復(fù)溫后加入聚合物輔助劑(試劑1)37℃孵育30min，PBS沖洗，入辣根酶標(biāo)記抗兔IgG多聚體 37℃孵育60min，1∶20 DAB顯色劑顯色5min，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，常規(guī)脫水固定，中性樹膠封片。

1.5.2 圖像處理 TNF-α及IL-6陽性細(xì)胞均為胞漿或胞核呈棕黃色或深棕黃色顆粒，在NIKON Eclipse 80i生物顯微鏡下以高倍鏡(×40)觀察，選取染色均勻的3-5個視野的陽性表達(dá)細(xì)胞，應(yīng)用NIS-Elements Basic Research圖像采集分析系統(tǒng)統(tǒng)計每個視野下陽性顆粒的表達(dá)面積(Area)和積分光密度(SumDensity)，以反映 TNF-α和 IL-6在肝組織中的分布強(qiáng)度。

1.6 酶聯(lián)反應(yīng)法測定TNF-α、IL-6含量

肝組織稱重后在冰浴(4℃)中制成10%的組織勻漿，4000r/min離心10min取上清，生理鹽水稀釋成5%的組織勻漿用于檢測，嚴(yán)格按照說明書建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行樣本測定和結(jié)果計算。

1.7 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)利用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行LSD組間比較，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二陳湯、桃紅四物湯對大鼠肝組織病理改變的影響

圖1～5顯示，40倍光鏡下觀察肝組織HE染色切片，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細(xì)胞無變性、壞死，可及肝竇充血。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞呈脂肪變性顯著，視野滿布中到小泡性脂肪變性，可及大泡脂肪空泡，呈局灶分布伴空泡融合，病變以中央靜脈周圍嚴(yán)重，脂肪變性肝細(xì)胞腫脹，胞核被脂肪空泡推擠發(fā)生偏移、變形，細(xì)胞核深染，可見到肝竇充血、炎細(xì)胞浸潤，各組藥物影響肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積、脂肪變性的側(cè)重不同。桃紅四物湯使肝臟脂質(zhì)沉積更局限于中央靜脈周圍，同時可以減少肝細(xì)胞脂肪變性的面積;二陳湯可降低肝細(xì)胞脂肪變性的密度及脂肪空泡的體積，西藥也可降低脂肪變性的密度。

圖1 正常組大鼠肝組織(HE×40)

圖2 模型組大鼠肝組織(HE×40)

圖3 西藥組大鼠肝組織(HE×40)

圖4 二陳湯組大鼠肝組織(HE×40)

圖5 桃紅四物湯組大鼠肝組織(HE×40)

2.2 二陳湯、桃紅四物湯對大鼠肝組織TNF-α、IL-6表達(dá)的影響

2.2.1 二陳湯、桃紅四物湯對大鼠肝組織TNF-α表達(dá)的影響 圖6表1顯示，正常肝組織內(nèi)TNF-α陽性表達(dá)極少，僅在匯管區(qū)周圍偶見單個陽性表達(dá)細(xì)胞;模型組大鼠肝組織內(nèi)TNF-α明顯增多(P<0.01)，肝細(xì)胞腫脹變形，陽性表達(dá)細(xì)胞在匯管區(qū)及大血管周圍分布明顯增多;二陳湯組、桃紅四物湯組大鼠陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量與模型組比較顯著減少(P<0.01)，對照組與模型組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖6 不同組大鼠肝組織TNF-α表達(dá)的比較(SF二步法×40)

表1 不同組大鼠肝組織TNF-α表達(dá)的比較

表1 不同組大鼠肝組織TNF-α表達(dá)的比較

注:與正常組比較:＊＊P<0.01;與模型組比較:▲▲P<0.01

組別 樣本量n(只)平均陽性面積Area(×104μm2)積分光密度SumDensity(×104)正 常 組12 0.04±0.05 0.02±0.03模 型 組 13 5.71 ±2.70＊＊ 4.02±2.04＊＊對 照 組 15 5.18±1.89 3.43±1.23二 陳 湯 組 15 4.16±2.33▲▲ 2.73±1.50▲▲桃紅四物湯組 15 4.23±1.78▲▲ 2.72±1.13▲▲

2.2.2 二陳湯、桃紅四物湯對大鼠肝組織IL-6表達(dá)的影響 圖7表2顯示，正常肝組織內(nèi)IL-6陽性表達(dá)極少，僅在匯管區(qū)周圍偶見單個陽性表達(dá)細(xì)胞;模型組大鼠肝組織內(nèi)IL-6陽性表達(dá)區(qū)域明顯增多(P<0.01)，肝細(xì)胞腫脹變形，陽性表達(dá)細(xì)胞在匯管區(qū)及大血管周圍分布明顯增多;對照組、二陳湯組、桃紅四物湯組大鼠肝組織陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量與模型組相比較明顯減少(P<0.01)。

2.3 二陳湯、桃紅四物湯對大鼠肝組織 TNF-α、IL-6含量的影響

表3顯示，與正常組比較，模型組大鼠肝組織TNF-α、IL-6含量明顯升高(P<0.05);與模型組相比，二陳湯組大鼠肝組織 IL-6含量明顯下降(P<0.05)，TNF-α含量無明顯下降;桃紅四物湯組大鼠肝組織TNF-α、IL-6含量無明顯下降;西藥對照組大鼠肝組織TNF-α含量明顯下降(P<0.05)，IL-6含量無明顯下降。

圖7 不同組大鼠肝組織IL-6表達(dá)的比較(SF二步法×40)

表2 不同組大鼠肝組織IL-6表達(dá)的比較

表2 不同組大鼠肝組織IL-6表達(dá)的比較

注:與正常組比較:＊＊P<0.01;與模型組比較:▲▲P<0.01

組別樣本量n(只)平均陽性面積Area(×104μm2)積分光密度SumDensity(×104)正 常 組12 0.045±0.043 0.033±0.032模 型 組 13 8.620 ±4.006＊＊ 6.734 ±3.077＊＊對 照 組 15 3.260±2.198▲▲ 2.515±1.697▲▲二 陳 湯 組 15 5.040±1.834▲▲ 3.897±1.435▲▲桃紅四物湯組 15 4.000±1.742▲▲ 3.067±1.351▲▲

表3 不同組大鼠肝組織TNF–α、IL-6含量的比較

表3 不同組大鼠肝組織TNF–α、IL-6含量的比較

注:與正常組比較:*P<0.05，＊＊P<0.01;與模型組比較:▲P<0.05

組別 樣本量n(只)IL-6含量(pg/ml)TNF-α 含量(pg/ml)正 常 組12 17.309± 9.314 6.450±3.045模 型 組 13 39.431±23.985＊＊ 10.567±3.120*對 照 組 15 34.865± 7.714 6.362±3.569▲二 陳 湯 組 15 26.389±4.588▲ 7.928±1.715桃紅四物湯組15 28.409± 5.609 8.636±1.579

3 討論

3.1 TNF-α、IL-6與 NAFLD 的關(guān)系

研究證實(shí)，IR是NAFLD的基本特征，其可以直接或間接促進(jìn)肝脂肪變性、肝細(xì)胞損傷、炎癥和纖維化的發(fā)生。TNF-α、IL-6是已知的細(xì)胞因子中與NAFLD的發(fā)生發(fā)展關(guān)系最為密切的介質(zhì)之一。臨床研究發(fā)現(xiàn)，患者血清 TNF-α、IL-6水平與胰島素抵抗指數(shù)(H0MA-IR)均呈顯著性正相關(guān)，與是否合并代謝綜合征呈顯著性相關(guān)[7]，證明 TNF-α、IL-6通過誘導(dǎo)IR對NAFLD疾病本身的發(fā)生與發(fā)展起重要作用。TNF-α是腫瘤壞死因子家族中的重要一員，其通過肝細(xì)胞上TNF-α受體影響肝細(xì)胞脂肪代謝，降低胰島素受體絡(luò)氨酸激酶的活性，從而加重IR并與NAFLD的發(fā)生密切相關(guān)[8]。TNF-α既能直接損傷肝細(xì)胞，與肝細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，誘導(dǎo)肝細(xì)胞死亡，又能增加肝內(nèi)活性氧(ROS)產(chǎn)生，通過誘發(fā)炎癥介質(zhì)激活中性粒細(xì)胞等產(chǎn)生間接作用，加重肝細(xì)胞炎癥、損傷。致炎因子IL-6是多種細(xì)胞如單核吞噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和激活的 T淋巴細(xì)胞等對IL-1和TNF-α反應(yīng)的產(chǎn)物，IL-6主要作用于肝細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，刺激肝細(xì)胞合成纖維蛋白原等幾種血清蛋白，是活化的B淋巴細(xì)胞分化晚期的主要刺激因子。有研究顯示，胰島素依賴的AKT 的激活，明顯被 IL-6 抑制[9]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，四氯化碳聯(lián)合高脂飼料復(fù)制的NASH大鼠肝組織發(fā)生明顯的脂肪樣變性及炎癥反應(yīng)，肝細(xì)胞排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹變形，胞漿內(nèi)可見脂肪大泡，胞核固縮、偏移，中心靜脈區(qū)及匯管區(qū)有明顯的炎性細(xì)胞浸潤，肝組織內(nèi) TNF-α、IL-6表達(dá)和含量明顯增多，與文獻(xiàn)報道相一致，證明二者參與NAFLD的形成與發(fā)展，其具體機(jī)制可能與IR的形成、炎癥反應(yīng)及肝細(xì)胞損傷有關(guān)。

3.2 二陳湯與桃紅四物湯對NAFLD的影響

前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，二陳湯與桃紅四物湯能夠改善NAFLD大鼠的 IR 狀態(tài)，降低 ALT、AST、TBA、TBIL等指標(biāo)。通過上述方藥對NAFLD大鼠治療作用的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，二陳湯與桃紅四物湯能夠抑制肝組織內(nèi)過度表達(dá)的 TNF-α、IL-6，從而干預(yù)IR的形成，調(diào)整糖脂代謝紊亂，影響“第一次打擊”過程，同時又能減輕肝組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，起到保護(hù)肝細(xì)胞功能和改善肝損傷的作用，對“第二次打擊”進(jìn)行干預(yù)。兩方比較，二陳湯的作用效果優(yōu)于桃紅四物湯。

二陳湯首見于《太平惠民和劑局方》，治“痰飲為患，或嘔吐惡心，或頭眩心悸，或中脘不快，或發(fā)為寒熱，或因食生冷，脾胃不和”。其組成為半夏、橘紅、茯苓、炙甘草4藥共奏燥濕化痰、健脾滲濕、行氣祛痰之效。后世醫(yī)家多以本方為治療痰飲的主方，對痰飲引起的諸多病證常以本方為基礎(chǔ)化裁運(yùn)用。桃紅四物湯由四物湯加桃仁紅花組成，為治療血行瘀滯之良方。方中桃仁、紅花通利脈道，消血中瘀滯，熟地長于滋陰養(yǎng)血，川芎為“血中氣藥”，能行氣而活血;當(dāng)歸補(bǔ)血活血，赤芍活血祛瘀，甘草調(diào)和諸藥，全方合為養(yǎng)血活血化瘀之方，王清任之血府逐瘀湯、膈下逐瘀湯等皆由桃紅四物湯化裁而來。選用上述化痰與活血之基礎(chǔ)方，意在以方測法，探討化痰法與活血法對NAFLD大鼠的作用效果與作用靶點(diǎn)，進(jìn)一步以法測證，揭示NAFLD的病機(jī)關(guān)鍵。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，化痰之基礎(chǔ)方二陳湯作用較桃紅四物湯更為確切，以此推斷以肝組織炎癥表現(xiàn)為特征的NASH階段，中醫(yī)辨證應(yīng)為痰瘀互結(jié)，以痰為主。

3.3 化痰法治療NAFLD有其階段性

根據(jù)NAFLD痰瘀互結(jié)的理論，臨床上應(yīng)以化痰祛瘀為法選方用藥。而中醫(yī)的治療優(yōu)勢在于辨證論治，即同病異治，針對脂肪肝發(fā)展的不同階段調(diào)整治法用藥，因此化痰祛瘀法的應(yīng)用也應(yīng)有其側(cè)重。學(xué)習(xí)文獻(xiàn)和運(yùn)用現(xiàn)有中醫(yī)理論分析，NASH階段的患者表現(xiàn)為痰濕內(nèi)停、濕熱蘊(yùn)結(jié)，此時用藥應(yīng)以祛濕化痰為主。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，處在NASH階段大鼠對化痰基礎(chǔ)方二陳湯的治療更加敏感，反證了該階段的病理基礎(chǔ)以痰飲為主，為NAFLD中期治療應(yīng)以祛濕化痰為主提供了理論依據(jù)。NASH得不到控制，病情就會向肝纖維化發(fā)展，患者表現(xiàn)也多以口黏、納差乏力、脘腹痞滿、肝區(qū)脹悶疼痛、肝脾腫大變硬、舌質(zhì)瘀暗或見瘀點(diǎn)瘀斑、舌下脈絡(luò)瘀滯、脈細(xì)澀等瘀血內(nèi)停證為主，此時治療應(yīng)施以化痰散結(jié)活血通絡(luò)之法。正所謂“痰為瘀之漸，瘀為痰之變”，這也解釋了為何本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)活血基礎(chǔ)方桃紅四物湯對細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用不如二陳湯的機(jī)理。若探究化痰法與活血法應(yīng)用的具體時間點(diǎn)，還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探討。

[1]Day CP，James OF.Steatohepatitis:a tale of two“hits”[J].Gastroenterology，1998，114:842-845.

[2]范建高.非酒精性脂肪肝的病因和發(fā)病機(jī)制[J].胃腸病雜志，2003，8:363-365.

[3]曾民德.脂肪肝發(fā)病機(jī)制及其“二次打擊”假設(shè)[J].中華消化雜志，2002，22:167-168.

[4]黃靜娟，劉樹軍，車念聰.論痰瘀理論對非酒精性脂肪肝辨證與治療的指導(dǎo)作用[J].中華中醫(yī)藥雜志，2006，21(12):765-767.

[5]胡志闐.二陳湯和桃紅四物湯對非酒精性脂肪性肝病胰島素抵抗影響的動態(tài)實(shí)驗(yàn)研究[J].北京中醫(yī)藥，2009，28(4):305-307.

[6]劉樹軍，黃靜娟，車念聰.活血化痰基礎(chǔ)方對大鼠非酒精性脂肪肝模型 CYP2E1活性的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2008，18(2):109-111.

[7]謝伶俐，周力，李麗濱，等.TNF-α和I L-6在非酒精性脂肪性肝病患者血清中的水平及意義[J].世界華人消化雜志2010，18(14):1492-1496.

[8]Hotamisligil GS， ShargillNS， Spiegelm an BM .Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha:direct role in obesitylinked insulin resistance[J].Science 1993;259:87-91.

[9]Senn JJ，Klover PJ，Nowak IA et al.Interleukin-6 induces cellular insulin resistance in hepatocytes[J].Diabetes，2002，51:3391-3399.