苯酚高效降解菌的篩選及其降解特性研究

劉建忠,王 乾,顏家保,秦曉蓉,李凌凌

(武漢科技大學煤轉化與新型炭材料湖北省重點實驗室,湖北武漢,430081)

苯酚是一種應用廣泛的化工原料,但同時也是一種生物毒性物質,其對人體和環境中的其他生物均可造成不同程度的危害[1]。特殊環境中的少數微生物不僅能夠耐受苯酚,而且能以苯酚為生長的碳源和能源[2]。從被酚類物質污染的環境中篩選、馴化苯酚高效降解菌并應用于苯酚類物質的處理,具有經濟、安全以及所能處理的污染物閾值低、殘留少、無二次污染等優點,應用前景十分廣闊[3]。近年來,國內外已有不少從事苯酚降解菌的分離及降解特性研究的文獻報道[4-9],但如何提高苯酚降解效率、縮短工業廢水在凈化池中的停留時間還有待于進一步研究。

本文對從某焦化廠處理廢水的活性污泥中篩選苯酚高效降解菌進行試驗研究,并對其降解特性進行分析,以期為含酚廢水生物處理技術的應用提供依據。

1 試驗

1.1 試驗材料

分離菌株的活性污泥、混合菌群均采自某焦化廠廢水處理車間初曝池,焦化廢水中苯酚濃度約為300 mg/L。

富集培養基的組成包括[10]:牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、苯酚(根據需要加入),加蒸餾水定容至1 L,pH=7.0～7.2。

無機鹽培養基以苯酚為惟一碳源,其組成包括[11]:K2HPO40.4 g、KH2PO40.4 g、NaCl 0.1 g、M gSO4·H2O 0.2 g、M nSO4·H2O 0.01 g、Fe2(SO4)3·H2O 0.01 g、Na2MoO4·2H2O 0.01 g、(NH4)2SO41.0 g、苯酚(根據需要加入),加蒸餾水定容至1 L,pH=7.0～7.2。

1.2 菌種的篩選和馴化

按1%的接種量吸取2 m L活性污泥至200 mL苯酚濃度為300 mg/L的富集培養基中,在30℃、200 r/min的搖床中培養3 d,然后依次轉接至苯酚濃度分別為500、1 000、1 500 mg/L的富集培養基中。將經過苯酚濃度為1 500 m g/L的富集培養基富集后的菌體轉接至無機鹽培養基中馴化。采用稀釋涂布和劃線的方法,在分離培養基平板上分離篩選以苯酚為惟一碳源和能源的菌株。

1.3 固定化小球的制備

取對數期的菌懸液低速離心(5 000 r/min下離心15 min),棄上清液。菌體經生理鹽水充分洗滌后再次離心,收集菌體。稱取5 g濕菌體與100 m l 2%(質量分數)的海藻酸鈉混合均勻。分別用2、5、10 mL的注射器將海藻酸鈉與菌體的混合物以恒定的速度滴入8%(質量分數)的CaCl2溶液中,于4℃交聯鈣化后得到海藻酸鈉鈣凝膠小球。

1.4 檢測方法

微生物生長量的測定以空白培養基為對照,在600 nm處測吸光度。每個試樣設置兩個平行的試驗,數值取兩個平行試驗的平均值。

苯酚濃度采用改進的4-氨基安替比啉法測定[12-13]。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選與降解條件的優化

經反復馴化、涂板分離,共得到8株以苯酚為惟一碳源和能源而高效生長的菌株。通過比較發現其中3號菌株(命名為Wust-C,初步鑒定為香茅醇假單胞菌)降解苯酚的效率明顯高于其他菌株,故選其作為研究菌株,其革蘭氏染色結果為陰性。

通過一系列的降解條件優化試驗發現,含酚廢水的pH值對wust-C降解苯酚的效果有顯著的影響。中性或偏堿性的環境有利于該菌株對苯酚的降解,碳源和氮源的添加對菌株降解苯酚沒有明顯的改善作用。降解條件優化試驗結果表明,該菌株降解苯酚較合適的條件是:培養溫度為30℃,培養液pH值為7,搖床轉速為200 r/min,當三角燒瓶中無機鹽培養基的裝液量為90 m L時,菌種(OD600≈0.6)接菌量為10 m L。以下試驗均是利用該菌株在上述條件下進行的。

2.2 Wust-C的生長與苯酚的降解

將wust-C接入初始苯酚濃度為1 000 mg/L的無機鹽培養基中,每隔4 h測定一次培養基中的菌體濃度和苯酚含量,計算該菌體生長的平均OD值和苯酚平均降解率,得到如圖1所示的菌體生長和苯酚降解曲線。

圖1 菌株生長和苯酚降解曲線Fig.1 Curves of bacterial growth and phenol degradation

從圖1中可以看出,隨著菌體的大量增長,培養基中的苯酚殘余量迅速下降。由于接菌量較大,菌株停滯期非常短,很快進入對數期。菌體的快速增長使其對碳源的需求量迅速增大,苯酚降解迅速、濃度下降很快,經過24 h,苯酚降解率可達到98%。此后,由于培養基中的碳源已相對較少,加上代謝產物的不斷累積,使菌體的生長受到抑制,其數量增加緩慢,苯酚降解速度也趨緩。經過32 h,培養基中的苯酚可完全降解。

2.3 Wust-C對不同初始濃度苯酚的降解效果

wust-C在初始含酚濃度不同的培養基中對苯酚的降解特征如圖2所示。由圖2可見,Wust-C在以苯酚為惟一碳源的培養基中可有效降解不同濃度的苯酚。初始苯酚濃度越低,降解所需時間越短。在初始苯酚濃度為300 mg/L和500 mg/L的試樣中,苯酚完全降解所需的時間分別為8 h和12 h;在初始苯酚濃度為1 000 m g/L的試樣中,苯酚完全降解所需的時間為32 h;在初始苯酚濃度為1 600 mg/L的試樣中,菌體的生長速度和苯酚的降解速度均極其緩慢。培養4 h時,wust-C對初始含酚濃度分別為300、500、800、1 000 mg/L試樣中的苯酚降解率分別達到86.4%、59.3%、47.6%、41.7%。

圖2 Wust-C對不同初始濃度苯酚的降解效果Fig.2 Degradation of phenol with different initial concentrations by Wust-C

2.4 固定化Wust-C對苯酚的降解效果

通過比較采用2、5、10 m L注射器制作的Wust-C固定化小球(分別記為1#、2#、3#小球)在初始苯酚濃度為1 000 mg/L的培養基中對苯酚的降解情況發現,1#小球的降酚效率高于另外兩種小球。1#小球與游離菌在相似的條件下對初始苯酚濃度分別為1 000 mg/L和1 200 mg/L試樣中的苯酚降解情況如圖3所示。

由圖3可見,在相似的條件下,固定化細菌降解苯酚的效率顯著高于游離細菌。在初始苯酚濃度為1 000 mg/L的試樣中,培養12 h時,固定化細菌和游離細菌對苯酚的降解率分別為78%和68%,培養24 h時,兩者的苯酚降解率分別為100%和96.6%;在初始苯酚濃度為1 200 mg/L的試樣中,培養24 h時,固定化細菌和游離細菌對苯酚的降解率分別為100%和91.5%。游離細菌完全降解初始苯酚濃度為1 200 mg/L試樣中的苯酚需要48 h以上的時間。另外,固定化wust-C能在4 h內完全降解初始苯酚濃度為300 mg/L試樣中的苯酚,而且固定化小球可以重復使用,使用5次后其對苯酚的降解效率未出現明顯的下降。

圖3 固定化細菌和游離細菌對不同初始濃度苯酚的降解比較Fig.3 Comparison of the phenol degrading performance between free and immobilized bacteria

2.5 Wust-C接入混合菌后對苯酚的降解效果

將Wust-C分別以5%、10%、15%(體積分數)比例添加到混合菌群中,測定其對初始苯酚濃度為1 000 mg/L試樣中苯酚的降解特性,如圖4所示。

圖4 混合菌群添加Wust-C后對苯酚的降解效果Fig.4 Degradation of phenol by mixed bacterial consortia after adding Wust-C

由圖4可見,加入Wust-C后,混合菌群降解苯酚的效果得到改善,其中加入5%Wust-C的混合菌群降酚效果最優。在培養36 h時,加入5%wust-C的混合菌群已將苯酚完全降解。與加入15%Wust-C的混合菌群相比,加入10%Wust-C的混合菌群降酚效果略優,但二者都能在60～72 h內實現對苯酚的完全降解。而未加入Wust-C的混合菌在培養72 h時,對苯酚的降解率才達到98.5%。

3 結論

(1)從某焦化廠處理廢水的活性污泥中篩選到8株能以苯酚為惟一碳源和能源而高效生長的菌株,其中命名為Wust-C的菌株降解苯酚的效果較好。

(2)Wust-C的加入能增強混合菌群降解苯酚的能力,但這種改善作用并不隨Wust-C含量的增加而增強,表明混合菌群內不同菌株在降解焦化廢水中的污染物時存在著復雜的互作和共生關系。

(3)固定化處理可明顯提高Wust-C降解苯酚的效率。

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