早期胃癌的還氧合酶-2、抑癌基因P16和肝細(xì)胞生長因子表達(dá)

韓玉龍 ，孫 雷 ，尹家俊

(1.大連大學(xué) 附屬中山醫(yī)院 普外二科，遼寧 大連 116001；2.大連醫(yī)科大學(xué) 病理學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

胃癌是影響人類健康的常見的惡性腫瘤，其在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中占第1位，每年死于胃癌者25.16/10萬。隨著環(huán)境、飲食等因素的變化，其發(fā)病率正逐年增高。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多基因參與的多步驟的過程，與其他惡性腫瘤一樣，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。能夠找到在胃癌的發(fā)生發(fā)展中眾多基因相互作用的機(jī)制，一直是人們潛心研究的重要課題和努力方向。

還氧合酶(COX-2)、抑癌基因P16以及肝細(xì)胞生長因子(HGF)和胃癌的發(fā)生有一定的關(guān)系。但研究結(jié)論并不一致，而且有關(guān)早期胃癌中COX-2、P16 和HGF三者之間蛋白表達(dá)的相關(guān)性的研究至今未見報道。本研究試圖通過免疫組化方法檢測早期胃癌組織中COX-2、P16 和HGF蛋白表達(dá)，旨在探討三者之間的相關(guān)性及意義。

1 材料和方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院及大連市中心醫(yī)院2005～2007年間手術(shù)切除的早期胃癌30例。所有患者術(shù)前均未行放療及化療。同時，選擇同期10例不典型增生胃組織和10例正常胃組織作為對照。

1.2 試劑和方法

采用免疫組織化學(xué)SP法，COX-2一抗為鼠抗人單克隆抗體，購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，P16一抗為鼠抗人單克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，HGF一抗為兔抗人多克隆抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司，均為即用型試劑，SP超敏試劑盒：內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、正常非免疫動物血清、生物素標(biāo)記的第二抗體、鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶、DAB顯色試劑，均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 結(jié)果判定

COX-2和HGF陽性染色者在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿有棕黃色顆粒沉著，P16陽性染色者在細(xì)胞核或細(xì)胞漿有棕黃色顆粒沉著，兩位病理醫(yī)師獨(dú)立觀察每張切片隨機(jī)選區(qū)的10個高倍視野，采用雙評分半定量法，根據(jù)染色程度及染色細(xì)胞的百分率進(jìn)行評分，基本不著色者為0分，著色淡者為1分，著色深者為2分；著色細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞百分率<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。將每張切片著色程度得分與著色細(xì)胞百分率各自相乘，為其最后得分。0～1為陰性(-)，2～3為低度陽性(+)，4～5為中度陽性(++)，6以上為高度陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3樣本各自在3種之間的比較，采用多組有序變量資料的秩和檢驗(yàn)方法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，兩樣本間相關(guān)性分析，采用Kendall's tau-b 相關(guān)分析方法，當(dāng)P<0.05、R接近+1或-1時表明有顯著的相關(guān)性。所有統(tǒng)計均由SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包完成。

2 結(jié) 果

2.1 COX-2的表達(dá)情況

正常胃組織呈陰性表達(dá)；不典型增生胃組織陽性表達(dá)較多，且有3例強(qiáng)陽性表達(dá)，早期胃癌組織主要呈弱陽性至強(qiáng)陽性表達(dá)，主要位于腫瘤細(xì)胞的胞漿，在高倍鏡下呈棕黃色顆粒彌漫性的分布與癌細(xì)胞胞漿或沿核膜周邊呈線狀分布。由表1可見，正常胃組織→不典型增生胃組織→早期胃癌組織，COX-2呈上調(diào)趨勢。早期胃癌組織與正常胃組織比較、不典型增生胃組織與早期胃癌組織比較，差異具有顯著性意義(P<0.01)，而正常胃組織與不典型增生胃組織比較，差異無顯著性意義(P>0.05)。

2.2 P16的表達(dá)情況

在正常胃組織中，P16從不表達(dá)至強(qiáng)陽性，位于細(xì)胞核或細(xì)胞漿，也是呈現(xiàn)棕黃色顆粒彌漫性分布；在不典型增生胃組織中，呈不表達(dá)或弱陽性表達(dá)；在早期胃癌組織中，不表達(dá)和弱陽性表達(dá)率明顯升高，僅有2例強(qiáng)陽性表達(dá)。由表1可見，正常胃組織→不典型增生胃組織→早期胃癌組織，P16的表達(dá)呈下調(diào)趨勢。正常胃組織與不典型增生組織比較，差異無顯著性意義；不典型增生胃組織與早期胃癌組織比較、早期胃癌組織與正常胃組織比較，差異具有顯著性意義(P<0.01)。

2.3 HGF的表達(dá)情況

正常胃組織主要呈陰性表達(dá)，不典型增生胃組織呈陽性表達(dá)，且有2例強(qiáng)陽性表達(dá)；早期胃癌組織主要呈弱陽性至強(qiáng)陽性表達(dá)，僅有2例不表達(dá)。不典型增生胃組織和早期胃癌組織勻稱彌漫性分布于細(xì)胞的胞漿內(nèi)，在高倍鏡下呈棕黃色顆粒。由表1可見，正常胃組織→不典型增生胃組織→早期胃癌組織，HGF的表達(dá)呈上調(diào)趨勢。正常胃組織與不典型增生組織比較、不典型增生胃組織與早期胃癌組織比較、早期胃癌組織與正常胃組織比較，差異都具有顯著性意義。

2.4 COX-2、P16和HGF三者之間蛋白表達(dá)的相關(guān)性

通過相關(guān)性統(tǒng)計分析，在早期胃癌組織中， HGF與COX-2的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.628,P<0.01)，HGF 與P16的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.490,P<0.01)。

表1 COX-2、P16、HGF在早期胃癌組織、不典型增生胃組織和正常胃組織中的表達(dá)差異性的比較

COX-2：不典型增生胃組織比胃癌組織，P<0.01；胃癌組織比正常胃組織，P<0.01；P16：不典型增生胃組織比胃癌組織，P<0.01；胃癌組織比正常胃組織，P<0.01；HGF：正常胃組織比不典型增生組織，P<0.05；不典型增生胃組織比胃癌組織，P<0.01；胃癌組織比正常胃組織，P<0.01

3 討 論

環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)是花生四烯酸合成前列腺素(prostaglangins,PG)過程中的一個限速酶，目前已知 COX 至少有兩種同種異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)型 COX-1 和誘導(dǎo)型 COX-2。COX-2在多種腫瘤尤其是消化系統(tǒng)腫瘤組織及其相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)[1]。本研究結(jié)果，COX-2在正常胃組織至早期胃癌組織的表達(dá)呈上調(diào)趨勢，該結(jié)果和Sun等[2]的報道相一致，提示COX-2基因的激活可能是胃癌發(fā)生發(fā)展的重要因素，而正常胃組織與不典型增生胃組織相比，COX-2表達(dá)差異無顯著性意義，結(jié)果與張合喜等[3]的報道一致，但確切原因尚未知。

P16 基因位于人類第 9 號染色體短臂 2 區(qū) 1 帶(9p21)。人類 75%的癌細(xì)胞株有 p16 基因的缺失或突變。有研究報道在 p16 蛋白缺乏時腫瘤細(xì)胞的持續(xù)增殖能力可明顯提高[4],證明了 P16 蛋白是一種抑癌蛋白。本研究結(jié)果顯示，P16在正常胃組織至早期胃癌組織的表達(dá)呈下調(diào)趨勢,P16基因的失活可能是胃癌發(fā)生發(fā)展的重要因素。其失活機(jī)制可能為：①基因缺失或突變:包括純合缺失、雜合缺失、基因內(nèi)堿基缺失、點(diǎn)突變。②甲基化:p16基因突變和缺失具有腫瘤類型的傾向性,但在某些腫瘤中其突變和缺失較少見[5]。

HGF是一異二聚體,HGF蛋白分子由A鏈和B鏈通過二硫鍵相連接,由728個氨基酸組成,HGF現(xiàn)在已被認(rèn)為是一種具有多種功能的細(xì)胞因子[6]，原癌基因c-Met編碼產(chǎn)物是HGF的受體,因此HGF的受體也稱為c-Met受體[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，HGF在正常胃組織至胃癌組織的表達(dá)呈上調(diào)趨勢。結(jié)果與Kermorgant S[8]報道一致，提示HGF蛋白表達(dá)與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。其可能的機(jī)制如下：HGF生物學(xué)活性是由原癌基因c-Met編碼的跨膜受體蛋白所介導(dǎo)[7],構(gòu)成HGF-c-Met通路。HGF-c-Met通路的激活對促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化，在其生長、侵襲過程中發(fā)揮重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在早期胃癌組織中，HGF蛋白表達(dá)隨COX-2蛋白表達(dá)的增高而上調(diào)，具有明顯的正相關(guān)性。說明HGF可能通過COX-2的相關(guān)調(diào)節(jié)途徑對胃癌的發(fā)生發(fā)展起一定作用。其可能的機(jī)制是：①腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生大量的前列腺素E2，作用于基質(zhì)成纖維細(xì)胞，使成纖維細(xì)胞生成大量的HGF，而COX-2 是前列腺素合成的限速酶[9]；②HGF能顯著的誘導(dǎo)COX-2蛋白的表達(dá)和前列腺素的釋放[10]。 ③HGF-c-Met信號通路可能通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶的激活作用所介導(dǎo)，上調(diào)COX-2及增加胃癌中前列腺素E-2(PGE-2)的生成[11]。

本研究結(jié)果顯示,在不典型增生胃組織到早期胃癌組織中，HGF的表達(dá)呈上調(diào)趨勢而P16呈下調(diào)趨勢。此途徑可能與P16對細(xì)胞周期的調(diào)控有關(guān)。真核細(xì)胞分裂必須通過 G1期→S期的轉(zhuǎn)換開始進(jìn)行 DNA合成,通過G2期→M期轉(zhuǎn)換進(jìn)入有絲分裂期,在這些轉(zhuǎn)換過程中,CDK起著重要作用，CDK通過調(diào)節(jié)底物Rb蛋白的磷酸化而促使G1→S和G2→M期的轉(zhuǎn)換,導(dǎo)致細(xì)胞增殖。P16蛋白與cyclinD 競爭結(jié)合 CDK4,能夠特異性抑制 CDK4 的活性從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期,抑制細(xì)胞增殖;相反cyclinD與CDK4結(jié)合時,刺激細(xì)胞生長、分裂,當(dāng)p16基因由于缺失或突變不能表達(dá)時,cyclinD與CDK4的結(jié)合占優(yōu)勢,過度刺激細(xì)胞分裂,使細(xì)胞呈失控性生長而形成腫瘤[12]。

本研究結(jié)果提示，COX-2、P16和HGF與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。HGF可能通過調(diào)節(jié)COX-2和P16的相關(guān)途徑在胃癌的發(fā)生發(fā)展起到一定的作用。但COX-2、P16和HGF是否通過同一條信號途徑在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起作用的機(jī)制尚不十分清楚，有待于進(jìn)一步研究。

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