BRAFV600E基因突變及p27蛋白表達與甲狀腺乳頭狀癌頸淋巴結轉移的關系①

盧軍峰，解乃昌，姬逸男

(廣西醫科大學第一附屬醫院胃腸腺體外科，廣西 南寧 530021)

近幾年眾多學者在甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer，PTC)中檢測到高頻率的BRAFV600E基因突變，并且認為BRAFV600E突變與細胞周期調控因子p27的表達異常密切聯系相關，其突變或表達異常會引起細胞的失控性生長，進而發生腫瘤和淋巴結轉移［1］。本文通過檢測PTC中BRAFV600E突變及p27蛋白的表達測定，并結合臨床病理參數的研究，為PTC頸淋巴結轉移的危險因素評估提供一定的依據。

1 材料和方法

1.1 臨床資料:收集廣西醫科大學第一附屬醫院病理科2004年9月至2010年3月存檔83例PTC蠟塊，均為首次手術且術前未行放射碘治療。術后及實驗前經2位病理科專家再次確診。患者年齡最小12歲，最大76歲，平均年齡45歲。男性17例，女性66例。

1.2 DNA提取、瓊脂糖凝膠電泳、PCR－SSCP檢測、BRAFV600E基因DNA序列分析:將各蠟塊對照相應的HE切片，切成8μm厚切片，烤片脫蠟脫水并刮入1.5mL EP管中，經消化裂解粗提DNA。以DNA提取液為反應模板，用特異性引物擴增BRAF基因第15外顯子。擴增產物皆經瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的基因片段。以12%非變性聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳，銀染。回收及純化經PCR－SSCP篩選出有突變的DNA擴增樣品。由北京諾賽基因組研究中心有限公司對樣品測序。

1.3 免疫組織化學法:采用鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化物酶連接法(SP法):按抗體說明書(福建邁新生物技術公司)推薦的高壓抗原修復法及相應實驗步驟操作。由試劑公司提供陽性對照片，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 p27蛋白半定量表達的測定:p27蛋白陽性定位于胞核或胞漿。每張切片隨機選取10個高倍鏡視野，據染色程度和著色細胞百分率進行判斷:基本不著色記0分，按染淡黃色、棕黃色、棕褐色依次記為1－3分;著色細胞占計數細胞百分率≤5%記0分，6% －25%記1分，26% －50%記2分，＞50%記3分。據兩項得分乘積評分:分值＜2者為染色陰性，分值≥2者為染色陽性。免疫組化結果見圖1。

圖1 PTC中CyclinD1和p27蛋白免疫組化表達

1.5 統計學處理:采用SPSS 15.0統計軟件，率的比較應用X2檢驗。對分析影響淋巴結轉移的獨立影響因素利用Back stepwise LR檢驗分析，檢驗水準以P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 本研究中83例PTC臨床病理參數資料如表1所示。

表1 83例PTC頸淋巴結轉移與否的臨床病理因素關系

83例PTC頸淋巴結轉移情況在性別(P=0.224)、原發腫瘤直徑(P=0.279)、病灶單雙葉(P=0.220)的差異無顯著性;而在年齡(P=0.029)、病灶突破腺體包膜(P=0.005)、臨床分期(P=0.015)、BRAFV600E突變(P=0.007)和 p27(P ＜0.001)的差異有顯著性。在檢測出BRAFV600E基因突變陽性的41例PTC中，p27蛋白陰性率為 68%(28/41)。在BRAFV600E突變陽性PTC中p27呈低表達，基因突變組與野生組PTC在p27(P＜0.001)表達的差異有顯著性。

2.2 甲狀腺乳頭狀癌頸淋巴結轉移危險因素的多因素分析，見表2。

表2 83例甲狀腺乳頭狀癌患者頸淋巴結轉移危險因素的多因素分析

3 討論

BRAF基因，又名鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1，是RAF基因家族成員，位于人染色體7q34，含18個外顯子，編碼蛋白質分子全長約94 kD，有783個氨基酸殘基，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白質激酶類，是MAPK激酶家族里最高效的磷酸化劑，在凋亡和增殖過程中起重要作用，調節細胞的生長發育。BRAFV600E突變最初是Davies［2，3］等在惡性黑色素瘤的研究中被發現，目前大量研究表明，BRAFV600E突變同樣發生于甲狀腺癌，且其發生率非常高，僅次于黑色素瘤。

p27屬于細胞周期抑制蛋白(kinase inhibition protein/cyclin inhibition protein，KIP/CIP)家族成員，能抑制不同類型的細胞周期蛋白(Cyclin)與細胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin－dependent kinase，CDK)形成Cyclin－CDK復合物，阻礙細胞周期由G1期進入S期，對細胞周期起負調控作用。它在多種腫瘤中的異常表達顯示出其與腫瘤的密切關系。p27蛋白低表達使其抑制細胞增長功能降低，細胞過度增殖，導致腫瘤發生。p27在多種腫瘤中低表達，是判斷預后的重要指標，腫瘤中p27蛋白表達越低預后越差［4］。

本研究中實驗病例皆為分化型甲狀腺乳頭狀癌，臨床病理評估因素除性別、年齡、原發灶大小、腫瘤分期等外，新增BRAFV600E基因突變和p27蛋白兩個參考因素，對PTC臨床病理預后風險評估體系參數(如AGES、AMES、MACIS、UICC － TNM 分期)起到很好的補充作用。單因素分析結果提示年齡、病灶突破腺體包膜、腫瘤分期、BRAFV600E基因突變和p27蛋白表達可以作為PTC頸淋巴結轉移的危險因素。淋巴結轉移組 PTC患者平均年齡較高、臨床分期較晚、BRAFV600E突變率高、p27蛋白呈低表達。BRAFV600E基因突變檢出率為48.7%，與相關研究［5］BRAF突變率為29%－83%的報道一致，且原發灶和轉移淋巴結中也常檢測到該基因突變，Meta分析揭示BRAFV600E突變型PTC組織侵襲力高，易浸潤甲狀腺周邊組織，臨床病理分期高。包膜受侵或發生淋巴結轉移的PTC患者BRAFV600E突變率更高，但有些數據差異無顯著性［6］，原因可能與病例數目不足有關。BRAFV600E突變組PTC中p27呈低表達，在黑色素瘤和PTC細胞中的一項最新研究報道［7］指出:BRAFV600E基因突變阻斷了細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)通路的中粘附控制，導致p27蛋白表達下調。但某些報道［8］中沒有確切的數據來證實BRAFV600E基因突變與p27表達下調之間的確切關系，需進一步的分子學實驗來驗證該理論。Pesutic－Pisac VA［9］等將PTC分為低危組(年齡＜45歲、女性、腫瘤直徑＜2cm、病理示乳頭狀或濾泡狀、腺體包膜完整、單發病灶、無淋巴結轉移)和高危組(年齡≥45歲、男性、腫瘤直徑≥2cm、病理示高柱狀嗜酸性硬化細胞型、突破腺體包膜、多發病灶、有淋巴結轉移)，指出低危組的PTC患者，如果p27蛋白呈低表達，該類PTC患者發生頸淋巴結轉移可能性仍較大。多因素分析結果提示年齡、BRAFV600E突變和p27蛋白低表達可以作為評估PTC頸淋巴結轉移的危險因素，與Rodolico V［7］等的研究結論相似。而性別、原發腫瘤大小、病灶單雙葉情況、病灶突破腺體包膜方面和腫瘤分期情況對PTC頸淋巴結轉移的危險因素評價意義不是很大。

綜合本實驗方法和實驗數據的分析，BRAFV600E突變和p27蛋白可以作為評估甲狀腺乳頭狀癌頸淋巴結轉移危險因素的參考指標，具有BRAFV600E基因突變和(或)p27蛋白低表達的PTC發生頸淋巴結轉移的可能性較大。

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［8］Motti ML，De Marco C，Califano D，et al.Loss of p27 expression through RAS－＞BRAF－＞MAP kinase－dependent pathway in human thyroid carcinomas［J］.Cell Cycle，2007，6(22):2817－2825.

［9］Pesutic － Pisac VA，Punda An，Gluncic Iv，et al.Cyclin D1 and p27 expression as prognostic factor in papillary carcinoma of the thyroid:Association with Clinicopathological Parameters［J］.Clinical Science，2008，49:643 －649.