上海地區2006-2009年分離的大腸埃希菌O157特征分析研究＊

盛躍穎 ,陳 敏 ,陳洪友 ,姜 華 ,張 曦 ,吳 凡

腸出血性大腸埃希菌(EnterohemorrhagicEscherichia coli,EHEC)O157∶H7是一種能引起出血性結腸炎,溶血性尿毒綜合征(Hemolytic uremic syndrome,HUS)等嚴重并發癥的新型病原菌。我國自1986年首次報告 EHEC O157∶H7感染病例以來。國內多個省市和地區陸續在腹瀉病患者、家畜家禽的糞便和食品中檢測出了 EHEC O157∶H7[1-2]。本實驗主要是通過聚合酶鏈反應(PCR)和脈沖場凝膠電泳技術對上海地區從腹瀉病人、牛糞及食品中分離的玻片凝集初篩為E.coliO157的菌株進行進一步分子特征研究,了解不同來源的各菌株之間的關系,為流行病學研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌株與細胞 4株 EHEC O157∶H7標準菌種:編號 G1329,G2534,來源于德國,由南開大學泰達生物技術學院提供;編號J4-92,J75-96,由日本京都大學竹田多惠博士惠贈。9株E.coliO157∶H7分離株:編號4,17于2006年分離自上海地區的腹瀉病人;編號780,782,783,784,798,799于2008年分離自上海某區縣同一監測點的牛糞;編號378為2009年分離自食品。2006-2009年分離的4株E.coliO157菌株:編號7,8,440,441,分離自牛糞。大腸埃希菌A TCC 25922作為陰性對照。沙門菌H9812作為PFGE實驗的分子量標準對照。Vero細胞株為本實驗室保存。

1.2 主要試劑與儀器 菌株的生化鑒定采用法國BioMerieux公司的API 20E微量生化試劑條,血清學分型采用泰國S&A公司的大腸埃希菌O157診斷血清。PCR反應液(Premix Taq○RVersion2.0),DL 1000 DNA marker,XbaⅠ內切酶購自大連寶生物有限公司;蛋白酶 K為 Promega公司產品;SeaKem Gold Agarose購自美國 Cambrex Bio Rockland公司;十二烷基肌氨酸鈉購自 Sigma公司。試劑均在有效期內使用。PCR擴增儀,脈沖場凝膠電泳儀(Chef-Mapper),凝膠成像儀(GEL Doc2000)均為美國Bio-Rad公司產品。

1.3 菌體抗原基因、鞭毛抗原基因及主要毒力基因的聚合酶鏈反應。

1.3.1 引物 檢測菌體抗原基因rfb O157,鞭毛抗原基因flic H7,志賀毒素 stx1、stx2,溶血素基因Hly,粘附抹平因子基因eaeA的引物序列見表1。

1.3.2 模板制備 采用熱裂解法,將待測菌株在普通營養瓊脂上37℃培養18～24 h,刮取2～3個菌落于200μL滅菌雙蒸水中混勻,100℃煮沸 15 min,直接用于PCR擴增。

1.3.3 rfb O157和flic H7基因檢測的反應條件PCR 反應液25μL,引物4條,每條0.5μL(10 pmol/μL),模板DNA 4μL,滅菌雙蒸水 19μL 至總體積50μL。反應程序:94℃5 min,模板DNA預變性,然后94℃30s,58℃30s,72℃1 min,35個循環,最后72℃延伸5 min.以標準菌株 G2534作陽性對照,大腸埃希菌A TCC25922作陰性對照。

1.3.4 stx1,stx2,hlyA,eaeA基因檢測的反應條件 PCR反應液 25μL,引物共 8條,其中引物VT1-F,V T1-R,V T2-F和 VT2-R每條 2μL(10 pmol/μL),EAE-F 和 EAE-R 每條 3μL(10 pmol/μL),Hly-F 和 Hly-R 每條 0.5μL(10 pmol/μL),模板DNA 4μL,滅菌雙蒸水10μL 至總體積50μL。反應程序:94℃5 min,模板DNA預變性,然后94℃30sn,58℃30s,72℃1 min,35個循環,最后72℃延伸5 min.以標準菌株 G2534作陽性對照,大腸埃希菌ATCC25922作陰性對照。

1.4 細菌染色體DNA酶切片斷的PFGE分析實驗步驟主要參照美國CDC病原菌分子分型監測網絡(PulseNet)的E.coliO157∶H7的PFGE標準化方法進行操作。采用的限制性內切酶為XbaⅠ。獲得的脈沖場凝膠電泳圖譜采用BioNumerics軟件(Version 6.0)對實驗菌株的染色體DNA酶切圖譜進行數據處理,并進行聚類分析。

表1 E.coliO157的特異基因檢測引物序列及擴增片斷長度Table 1 Primer sequences and lengths of PCRamplification products

1.5 Vero細胞毒性試驗 選擇志賀毒素(stx1或stx2)PCR檢測結果陽性的菌株進行Vero細胞毒性試驗。將待測菌株分別接種于5mL LB增菌液中37℃振蕩過夜后,使菌液濃度達到 108CFU/mL。吸取1mL增菌液用0.22μmL孔徑的濾膜過濾后,獲取過濾液備用。將Vero細胞包被到96孔平底細胞培養板,37℃5%CO2條件下培養24h,待細胞長成單層后,替換新鮮Vero細胞培養液100μL。然后加入獲得過濾液100μL,培養48-72h后,觀察致死性細胞病變情況。以75%細胞出現細胞病變為觀察終點。大腸埃希菌ATCC 25922作陰性對照。

2 結 果

2.1生化鑒定 13株上海分離株經API 20E鑒定為大腸埃希菌,除菌株7,8,440,441外,其余9株菌在24h內不發酵山梨醇。

2.2 血清學分型及菌體抗原O157、鞭毛抗原 H7的PCR檢測結果 13株菌株均與O157因子診斷血清的玻片凝集試驗均呈強凝集反應,且菌體抗原O157的特異基因檢測結果均為陽性;其中9株菌株與H7因子診斷血清的試管凝集試驗為陽性,且鞭毛抗原H7的特異基因檢測結果為陽性。結果見表2和圖1。

2.3 主要毒力基因PCR檢測及Vero細胞毒性試驗的結果 9株菌株的毒力基因檢測結果出現陽性,其Vero細胞毒性實驗結果均為陽性。結果見表1、圖2和圖3。

表2 E.coliO157各菌株血清分型、基因檢測及 Vero細胞毒性結果Table 2 Summary of serotyping,PCR testing and vero cell cytotoxicity assay ofE.coliO157 strains

2.2菌細胞PFGE電泳圖譜的聚類分析 17株E.coliO157菌株(包括4株標準株)分為10個型別(E01～E10)。其中13株上海分離株共分了6個型別(E01,E04,E05,E08,E09,E10)。結果見圖3。

3 討 論

腸出血性大腸埃希菌O157∶H7在世界各地包括中國都造成了不同規模的暴發流行,是全球公認的公共衛生問題。牛是該病原菌的主要自然宿主。本試驗中,對上海地區不同來源的大腸埃希菌O157進行了表型分析與鑒定,包括生化鑒定和血清學分型;同時用分子生物學的方法,包括 PCR方法和PFGE方法分析了各菌株是否攜帶主要毒力因子及菌株間的相關性。

采用了多重PCR方法對13株分離株進行了4個主要毒力基因(stx1,stx2,eaeA,hly)的檢測,結果顯示其中有8株菌株(6株牛糞分離株和2株腹瀉患者分離株)的主要毒力基因型均為stx2+eaeA+hly,為目前國內分離的EHEC O157∶H7主要毒力基因模式[7]。1株從食品中分離的E.coliO157∶H7,其毒力基因型為stx1+stx2+eaeA+hly,為上海地區首次從食品中分離到該菌,提示應加強對食品中EHEC O157∶H7的監測力度。

PFGE方法目前已是E.coliO157分子分型的常用方法[8]。應用BioNumerics分析軟件對13株上海分離株的XbaⅠ酶切后電泳圖譜進行識別分析,各菌株可出現17～21個酶切條帶,共分為6個型別。

從聚類圖可見,從食品中分離的一株E.coliO157∶H7(編號378),除 stx2基因外,帶有 stx1基因,與同樣攜帶有stx1基因的德國分離株 G2534的PFGE圖譜最為接近。由于stx1和stx2基因都位于細菌染色體的原噬菌體上,因此是否攜帶該基因會改變菌株的酶切圖譜。可見,在采用PFGE分型之前,先對菌株進行毒力基因或其他特征基因的檢測是有必要的。結合這兩部分實驗結果可以更好地分析菌株間的相關性,對流行病學的溯源分析等提供了更全面的信息。

10株牛糞分離株中,2008年從同一地區分離的6株牛糞分離株(編號780,782,783,784,798,799),有5株屬于同一型別,編號為784菌株與其他菌株也呈高相關,僅差異2個條帶。這6株牛糞分離株與2株日本分離株(編號J4-92,J75-96)的 PFGE圖譜相似度高,同源性達92%;而與具有相同毒力基因模式的2株病人糞便分離株(編號4,17)的PFGE圖譜存在明顯不同,提示本市不同來源的 EHEC O157∶H7菌株可能存在多種型別。另一方面由于攜帶該病原菌的家畜是潛在的傳染源,可通過多種途徑污染食品等造成該菌的散發,甚至暴發性流行。上海地區從牛糞中檢出攜帶有志賀樣毒素的菌株,說明應加強對動物糞便及其他可疑傳染源的實驗室監測,更深入地進行區域性的流行病學調查研究。

此外,另外4株從牛糞分離的E.coliO157菌株(編號7,8,440,441)根據酶切圖譜顯示的條帶數量和位置可以分為兩組,但這兩組圖譜與標準株和其他上海分離株的條帶差異大于7個,可判定兩者互為不相關菌株[9]。結合這4株牛糞分離株的 H7鞭毛特異基因和主要毒力基因檢測結果都為陰性,說明這4株菌不能被定義為EHEC O157∶H7。但此類菌株是否會存在其他毒力基因,需進一步檢測研究。

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