糞樣中產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離及cpe+菌株的鑒定

徐曉靜,孫 慶,趙李祥

產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perf ringens)是一種革蘭氏陽性、產(chǎn)生芽胞、嚴(yán)格厭氧及形成特殊莢膜的梭狀桿菌,是梭狀芽胞菌屬中的主要成員之一[1]。該菌廣泛存在于自然界的水源、土壤及人和動物腸道之中,主要引起人的食物中毒、氣腫疽和動物的壞死性腸炎和腸毒血癥。研究發(fā)現(xiàn),該菌至少可以產(chǎn)生15種以上的毒素,根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生4種致死性毒素(α、β、ε、ι毒素)的能力 ,將其分為 A、B、C、D、E 5種類型[2]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素(C.perf ringensenterotoxin,CPE)是一種分子量為35 kD毒素蛋白,主要由A型產(chǎn)氣莢膜梭菌在芽孢期產(chǎn)生,是致人食物中毒的非常重要的毒力因子。美國的流行病學(xué)資料表明,cpe+產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的食物中毒已占整個(gè)食物中毒病例總數(shù)的第2位。cpe基因既可位于產(chǎn)氣莢膜梭菌的質(zhì)粒上,也可位于染色體上。當(dāng)cpe基因位于細(xì)菌的染色體上時(shí),該種CPE陽性產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起人的食物中毒;而當(dāng)cpe基因位于細(xì)菌的質(zhì)粒上時(shí),可分為兩種類型,即cpe-IS1470-like型質(zhì)粒cpe基因、cpe-IS1151型質(zhì)粒cpe基因,可分別引起人的非食源性胃腸疾病及動物胃腸疾病(如抗生素相關(guān)腹瀉和散發(fā)性腹瀉)[3]。在我國,感染產(chǎn)氣莢膜梭菌的病例雖然報(bào)道比較少,也缺乏詳細(xì)的統(tǒng)計(jì)資料,但是由于衛(wèi)生條件和飲食習(xí)慣等因素,產(chǎn)氣莢膜梭菌也是一種不可忽視的致病菌。本研究有針對性地采集了人和動物的糞樣,對產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行了分離,并用生化實(shí)驗(yàn)和多重PCR方法對分離菌做了系統(tǒng)的鑒定。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由法國巴氏德研究所惠贈。

1.2 被檢糞樣來源 2003-2008年在江蘇省揚(yáng)州市、蘇州市、南通市等地不間斷地采集糞樣。樣品包括醫(yī)院的腹瀉病人糞便,來自屠宰場的豬糞便,奶牛飼養(yǎng)場的牛糞和山羊屠宰交易市場的山羊糞樣等,共計(jì)1 411份。

1.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離與鑒定 胰蛋白胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基(TSC)、硫羥乙醇酸鹽培養(yǎng)(FTG)均購自德國默克公司;硝酸鹽還原-動力試驗(yàn)、牛奶發(fā)酵試驗(yàn)、卵磷脂分解試驗(yàn)、乳糖發(fā)酵-明膠液化試驗(yàn)所用培養(yǎng)基等均按常規(guī)方法制備。糞樣的增菌處理、產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離、純化與生化鑒定(革蘭氏染色、硝酸鹽還原-動力試驗(yàn)、牛奶發(fā)酵試驗(yàn)、卵磷脂分解試驗(yàn)、乳糖發(fā)酵-明膠液化試驗(yàn))均按國標(biāo)方法進(jìn)行[4]。

1.4 多重PCR分型方法檢測分離菌及cpe基因的擴(kuò)增 根據(jù)文其乙等的報(bào)道合成了針對產(chǎn)氣莢膜梭菌α、β、ε、ι、CPE 和β2等 6 種毒素的多重 PCR 引物[5]。挑取 TSC培養(yǎng)基上分離的單菌落,放入到含300μL去離子水的試管中,煮沸10～15 min,10 000 r/min離心5 min,取上清作為 PCR反應(yīng)的模板。PCR反應(yīng)按文其乙等報(bào)道的進(jìn)行,每份樣品重復(fù)檢測3次。根據(jù)A型標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC8239的cpe基因的開放性閱讀框設(shè)計(jì)并了一對PCR引物。上游引物 :5′-TTA GGATCCA TGCTTAGTAACAATT TAAATCC-3′;下游引物 :5′-GGGGAATTCTTAAAATTTTTGAAATAA TATTGA-3′。PCR 反應(yīng)體積為50μL,其中含5μL的10×PCR反應(yīng)緩沖,10μL的 DNA模板,1μL的 dNTP(3 mmol/L),上、下游引物 (5μmol/L)各 1.5μL,和0.5μL的DNA聚合酶(5 U/μL),最后補(bǔ)加滅菌超純水至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性4 min,前5個(gè)循環(huán)擴(kuò)增條件為94℃30 s,40℃30 s,72℃80 s,然后按94℃30 s,50℃30 s,72℃80 s的溫度轉(zhuǎn)換模式進(jìn)行25個(gè)循環(huán),在72℃延伸7 min,4℃保存。將PCR產(chǎn)物回收、純化后送上海生工測序。

1.5cpe+分離株中cpe基因定位 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5],分別合成了引物。按所合成的引物,無論是染色體還是質(zhì)粒定位的cpe均可擴(kuò)增出0.6kb條帶。另外,染色體定位的cpe基因還可以擴(kuò)增出特異的大小約為1.3 kb的條帶,而cpe-IS1470-like型質(zhì)粒cpe基因可以擴(kuò)增出特異的大小約為1.6 kb的條帶,cpe-IS1151型質(zhì)粒cpe基因可以擴(kuò)增出特異的大小約為0.8 kb的條帶。在50μL PCR反應(yīng)中,加入終濃度為 1μM 的cpe-IS1470R1.3、cpe-IS1470-likeR1.6、cpe-IS1151R0.8和 1μMcpe-4F,及0.2μM的cpe-3F和cpe-4R引物混合物,3μL dNTP,5μL 10×PCR緩沖液和0.5μL(5 unit/μL)Taq DNA聚合酶與10 ng的DNA模板,補(bǔ)加超純水至50μL。PCR反應(yīng)條件如下:首先94℃預(yù)變性4 min,然后按94℃30 s,61℃30 s,68℃90 s的溫度轉(zhuǎn)換模式進(jìn)行40個(gè)循環(huán),最后在68℃條件下延伸7 min。取10μL PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中60 V電泳2 h,在紫外光下觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株分離及生化鑒定的結(jié)果從1 411份糞樣中分離、鑒定出了557株產(chǎn)氣莢膜梭菌,分離率達(dá)到39.5%,見表1。生化實(shí)驗(yàn)顯示,分離菌能在 TSC培養(yǎng)基中形成黑色菌落;可以水解卵磷脂、發(fā)酵乳糖;可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,而且沒有動力,能液化明膠。

2.2 多重PCR方法對分離株毒素基因分型的結(jié)果利用多重PCR對557個(gè)產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株定型。表1和圖1顯示,經(jīng)鑒定本次分離到的557株產(chǎn)氣莢膜梭菌中有A和C兩種型:A型產(chǎn)氣莢膜梭菌為533株,并且包含了A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的3種類型,即β2-cpe-A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(泳道7),cpe+A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(泳道8),β2+A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(泳道9);C型產(chǎn)氣莢膜梭菌為24株,包含兩種亞基因型即β2-型(泳道10)和β2+型(泳道11)。本研究共分離到80株β2+產(chǎn)氣莢膜梭菌和一株cpe+A型產(chǎn)氣莢膜梭菌,沒有檢測到B、D和 E型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

2.3cpe+分離株cpe基因開放閱讀框的擴(kuò)增及序列確定 圖2顯示cpe+A型產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株經(jīng)PCR擴(kuò)增,可擴(kuò)增出大小約為960bp的產(chǎn)物,這與報(bào)道的cpeORF的大小相符。測序結(jié)果顯示分離株cpe擴(kuò)增片段的核苷酸序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC8239腸毒素基因的同源性達(dá)到99.9%,推導(dǎo)氨基酸同源性為100%。

2.4 多重PCR方法對cpe+分離株的cpe定位的結(jié)果 以染色體cpe+A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(NCTC 8239和 NCTC 8798)、cpe-IS1470-like型質(zhì)粒cpe陽性A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(F 5603)、cpe-IS1151型質(zhì)粒cpe+A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(F 4969)作陽性對照,用多重PCR方法對cpe+產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株的cpe定位。圖3顯示,本研究分離到的cpe+A型產(chǎn)氣莢膜梭菌擴(kuò)增出0.6kb條帶和1.3kb的條帶,這與位于第二泳道的染色體型cpe+A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(NCTC8239)擴(kuò)增出的兩條條帶位置一致;由此可見這株cpe+A型產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株為染色體cpe+A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

表1 糞便樣本中產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離與鑒定Table 1 The presence ofC.perf ringensisolates from fecal samples

3 討 論

本研究是對人畜體內(nèi)的產(chǎn)氣莢膜梭菌分布情況的一次較大規(guī)模的調(diào)查。從采樣對象上看,本研究的采樣的范圍有鮮明的特點(diǎn),主要是針對我國的3種主要家畜:豬、奶牛和羊。這些動物的肉制品或乳制品即將進(jìn)入食品流通市場,擺上人們的餐桌。所以,就這一點(diǎn)來說,本研究與人們的日常生活密切相關(guān),具有很重要的實(shí)際意義。另外,本研究對醫(yī)院腹瀉病人的糞樣進(jìn)行了檢測,即直接對患胃腸道疾病人群的產(chǎn)氣莢膜梭菌分布狀況進(jìn)行調(diào)查,用以研究產(chǎn)氣莢膜梭菌與人胃腸道疾病之間的關(guān)系,因此本研究的結(jié)果也具有一定的臨床價(jià)值。調(diào)查中,奶牛糞便樣品分離率最高,為70.4%,提示我們奶牛是產(chǎn)氣莢膜梭菌重要的攜帶者。

多重 PCR分型的結(jié)果表明,本研究分離到的557株產(chǎn)氣莢膜梭菌中A型為533株,占菌株總數(shù)的95.7%;C型為24株,占4.3%。A型產(chǎn)氣莢膜梭菌為優(yōu)勢菌群,這與國內(nèi)外流行病學(xué)資料相吻合。所有分離株中,80株為β2+,占總分離菌的14.4%,與文其乙等報(bào)道的(15.0%)基本一致[5]。β2毒素是近年來最新發(fā)現(xiàn)的一種與動物腸道疾病有密切關(guān)系的產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素[6],本研究從42株人腹瀉樣品分離菌中鑒定出10株β2毒素菌,β2毒素陽性率高達(dá)23.8%,這提示我們β2毒素與人的腹瀉等胃腸疾病有密切聯(lián)系。

CPE陽性A型產(chǎn)氣莢膜梭菌是引起食物中毒是重要致病因子,由該菌引起的食物中毒是3大細(xì)菌性食物中毒之一,在全球范圍內(nèi)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本次調(diào)查從42株產(chǎn)氣莢膜梭菌人源分離株中鑒定出1株CPE陽性A型產(chǎn)氣莢膜梭菌,經(jīng)PCR鑒定后發(fā)現(xiàn)cpe基因位于染色體上,而不是位于質(zhì)粒上。研究表明當(dāng)cpe基因位于染色體上,CPE陽性A型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起人的食物中毒,而質(zhì)粒源CPE陽性A型產(chǎn)氣莢膜梭菌可致人的抗生素相關(guān)性腹瀉和散發(fā)性腹瀉,可見該腹瀉病例可能是食物中毒病例。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),平均每起CPE陽性A型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的食物中毒的暴發(fā),通常涉及50-100人,有些嚴(yán)重的甚至涉及到上千人[7]。這表明該病例可能只是冰山一角,可能還涉及到更大范圍的食物中毒事件。隨著人們生活水平的提高,日常飲食中肉類比重越來越高。肉制品又是產(chǎn)氣莢膜梭菌的重要載體,因此加強(qiáng)肉制品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測刻不容緩。

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