RP-HPLC法測定復(fù)方酪薩維口腔速崩片中酪薩維和紅景天苷的含量Δ

周曉明，姚敏娜，曹金一，丁愉，趙美，湯海峰#

（1.第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院藥劑科，西安市 710032；2.解放軍第 94162部隊，西安市 710614）

RP-HPLC法測定復(fù)方酪薩維口腔速崩片中酪薩維和紅景天苷的含量Δ

周曉明1，2＊，姚敏娜1，曹金一1，丁愉1，趙美1，湯海峰1#

（1.第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院藥劑科，西安市 710032；2.解放軍第 94162部隊，西安市 710614）

目的：建立測定復(fù)方酪薩維口腔速崩片中酪薩維和紅景天苷含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法。色譜柱為Agilent TC-C18（250mm×4.6mm，5μm），流動相分別為0.2%磷酸溶液-乙腈＝86∶14（酪薩維）、甲醇-水＝15∶85（紅景天苷），柱溫為35℃，流速為1.0mL·min-1，檢測波長分別為254nm（酪薩維）、275nm（紅景天苷）。結(jié)果：酪薩維和紅景天苷進樣量的線性范圍分別為0.08～1.60μg（r＝0.9998）、0.80～8.00μg（r＝0.9993）；平均加樣回收率分別為100.22%（RSD＝1.58%，n＝6）、99.37%（RSD＝1.35%，n＝6）。結(jié)論：本方法操作簡便、結(jié)果準確、專屬性強、重復(fù)性好，可用于復(fù)方酪薩維口腔速崩片的質(zhì)量控制。

復(fù)方酪薩維口腔速崩片；酪薩維；紅景天苷；反相高效液相色譜法；含量測定

景天科紅景天屬（Rhodiola）為多年生草本或亞灌木植物，全世界共有90多種，其中我國約70余種[1]。國內(nèi)、外研究表明，紅景天具有抗缺氧、抗疲勞、抗輻射、抗衰老及增強腦力、體力機能等方面的特殊功效[2，3]，其抗缺氧、抗疲勞作用已通過大量實驗證實和臨床驗證。其主要有效成分是苯乙基苷類的紅景天苷（Salidroside）及其苷元酪醇，因此目前紅景天藥材及其制劑均將紅景天苷作為質(zhì)控指標，并以它的含量來區(qū)分藥材優(yōu)劣。但本屬的薔薇紅景天不僅具有優(yōu)于其他紅景天品種的抗疲勞和抗缺氧作用，還具有獨特的雙向調(diào)節(jié)功效。酪薩維（Rosavin）為薔薇紅景天中的特有成分，因此推斷其顯著的藥效和獨特的雙向調(diào)節(jié)功效可能與酪薩維有關(guān)[4]。目前開發(fā)的紅景天制劑多為膠囊劑、片劑、口服液等口服劑型，均具有起效慢、攜帶不便等缺點，不能適應(yīng)突發(fā)應(yīng)急的需要。筆者經(jīng)過反復(fù)試驗，最終以薔薇紅景天提取物為主藥，配以冰片、低取代羥丙基纖維素等輔料，采用粉末直接壓片技術(shù)，研制了復(fù)方酪薩維口腔速崩片，這種技術(shù)在紅景天制劑中首次應(yīng)用。筆者以酪薩維和紅景天苷為指標，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定復(fù)方酪薩維口腔速崩片中這2種成分的含量，以為進一步制定該制劑的質(zhì)量標準提供試驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC10A型HPLC儀、SPD10A型紫外檢測器（日本島津公司）；BS110S型電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；DL-360A超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司，功率：200W，頻率：40kHz）。

酪薩維（批號：200412）、紅景天苷（批號：200404）對照品均購自中國藥品生物制品檢定所；復(fù)方酪薩維口腔速崩片（第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院藥劑科自制，批號：091101、091102、091103）；乙腈為色譜純，水為純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流速：1.0mL·min-1；柱溫：35℃；測定酪薩維的流動相為0.2%磷酸溶液-乙腈（86∶14），檢測波長為254nm；測定紅景天苷的流動相為甲醇-水（15∶85），檢測波長為275nm。酪薩維和紅景天苷的HPLC分別見圖1、圖2。

圖1 酪薩維的HPLC圖A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；a.酪薩維Fig1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test sample；C.negative control；a.rosavin

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取酪薩維對照品4mg，用甲醇定容于50mL容量瓶中，加入甲醇超聲溶解，放冷至室溫，定容，制成0.08mg·mL-1的酪薩維對照品溶液。另精密稱取紅景天苷對照品4mg，置10mL容量瓶中，加入甲醇超聲溶解，放冷至室溫，定容，制成0.4mg·mL-1的紅景天苷對照品溶液。

圖2 紅景天苷的HPLC圖A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；a.紅景天苷Fig2 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test sample；C.negative control；a.rosavin

2.2.2 供試品溶液 取本品5片（片重為0.6g），精密稱定，研細，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，搖勻，稱重，超聲處理45min，放冷至室溫，稱重，用甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得酪薩維的供試品溶液。另取本品10片（片重為0.6g），精密稱定，研細，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，搖勻，稱重，超聲處理30min，放冷至室溫，稱重，用甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得紅景天苷的供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液 取不含薔薇紅景天提取物處方同法制備的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密稱取酪薩維對照品8mg，用甲醇定容于50mL容量瓶中，分別精密移取該溶液0.5、2、4、6、8、10mL，置于10mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得濃度分別為8、32、64、96、128、160μg·mL-1的對照品溶液。按上述色譜條件分別進樣10μL，測定峰面積。以進樣量（X，μg）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，制備標準曲線，得酪薩維的回歸方程為Y＝574697X+9680.8（r＝0.9998，n＝6）。結(jié)果表明，酪薩維進樣量在0.08～1.60μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。另精密稱取紅景天苷對照品20mg，用甲醇定容于25mL容量瓶中，分別精密移取該溶液0.5、1、2、3、4、5mL，置于5mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，分別進樣10μL，計算峰面積。以進樣量（X，μg）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，制備標準曲線，得紅景天苷的回歸方程為Y＝468863X+17546（r＝0.9993，n＝6）。結(jié)果表明，紅景天苷進樣量在0.80～8.00μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取酪薩維和紅景天苷對照品溶液各10μL，重復(fù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，二者的RSD分別為0.83%和0.64%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，分別于制備完成后0、2、4、8、12、24h按上述色譜條件進樣10μL，記錄酪薩維和紅景天苷的峰面積。結(jié)果，二者的RSD分別為1.26%和1.65%（n＝6），表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗 精密稱取復(fù)方酪薩維口腔速崩片（批號：091102）適量，共6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣10μL，測定酪薩維和紅景天苷的含量。結(jié)果，二者的RSD分別為1.10%和1.47%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 取同一批復(fù)方酪薩維口腔速崩片（批號：091102）適量，共6份，精密稱定，分別加入一定量的酪薩維和紅景天苷對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述方法測定，計算加樣回收率，結(jié)果分別見表1、表2。

表1 酪薩維的加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab1 Results of recovery test of rosavin（n＝6）

表2 紅景天苷的加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab2 Results of recovery test of salidroside（n＝6）

2.4 樣品含量測定

取3個批號的樣品，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下分別進樣10μL，測定樣品中酪薩維和紅景天苷的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品中酪薩維和紅景天苷的含量測定結(jié)果（n＝3）Tab3 Content determination of rosavin and salidroside in samples（n＝3）

從表3中結(jié)果可看出，復(fù)方酪薩維口腔速崩片平均每片含酪薩維0.823mg（0.140%），含紅景天苷0.390mg（0.065%）。

3 討論

為了達到口腔速崩制劑所規(guī)定的崩解時限與口感要求，筆者在研制復(fù)方酪薩維口腔速崩片的過程中加入了多種藥用輔料，但在含量測定中，該制劑經(jīng)過超聲法提取后在HPLC圖中未出現(xiàn)過多雜質(zhì)峰，尤其是在檢測成分峰周圍未見有雜質(zhì)峰影響，說明這種超聲提取的方法適用于此種制劑。

紅景天苷為紅景天屬植物的活性成分，且2010年版《中國藥典》[5]規(guī)定以紅景天苷的含量作為紅景天藥材的質(zhì)量控制標準，紅景天制劑[6，7]也多采用紅景天苷作為含量測定標準。但本制劑中主要原料藥為薔薇紅景天提取物，而酪薩維又是其特有的成分，如果僅選用紅景天苷的含量作為其質(zhì)量控制的標準就略顯不足，所以筆者將酪薩維和紅景天苷的含量測定共同作為復(fù)方酪薩維口腔速崩片的質(zhì)量標準。

試驗過程中，筆者一直致力于尋找一種更適合的方法可以同時測定紅景天苷和酪薩維2種成分的含量，但由于酪薩維的化學結(jié)構(gòu)中含有更長的共軛結(jié)構(gòu)，紫外吸收有明顯的紅移，二者沒有共同的最大吸收波長，若測定過程中以一種成分的最大吸收波長為檢測波長，則另一種成分的吸收峰會很低，不利于測定值的準確；若兼顧二者，采取折中的吸收波長，則會使二者測定值均有所降低；而且2種成分的極性比較大，如果側(cè)重于測定紅景天苷的含量，采用其洗脫比例，則酪薩維在此條件下的出峰時間會大大延長，甚至達3h以上，使試驗效率降低。雖然梯度洗脫可以解決這一問題，但很多基層單位使用的是單泵液相色譜儀，儀器達不到要求，不利于制劑的常規(guī)檢驗。綜合考慮，本試驗采用了2種制備方法和液相色譜條件分別測定復(fù)方酪薩維口腔速崩片中酪薩維和紅景天苷的含量。此種方法操作簡便、結(jié)果準確、專屬性強、重復(fù)性好、適用性強，可用于復(fù)方酪薩維口腔速崩片的質(zhì)量控制。

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].第1版.北京：科學出版社，1984：161.

[2] 趙 慧，賈凌云，孫長山，等.RP-HPLC法測定復(fù)方紅景天片劑中紅景天苷的含量[J].沈陽藥科大學學報，2005，22（1）：23.

[3] 戚志華，王慶偉，王四旺，等.HPLC法測定不同生長期女貞子中紅景天苷的含量[J].中國藥房，2010，21（11）：997.

[4] A Panossian，N Nikoyan，N Ohanyan，et al.Comparative study ofRhodiolapreparations on behavioral despair of rats[J].Phytomedicine，2008，15（1-2）：84.

[5] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：144.

[6] 孫成宏，鄧虹珠，易延逵.復(fù)方紅景天片質(zhì)量標準的研究[J].山西醫(yī)科大學學報，2009，40（1）：64.

[7] 宋興發(fā)，尚 強，高 山.紅景天養(yǎng)生片中紅景天苷的含量測定[J].醫(yī)藥導報，2009，28（12）：1629.

Content Determination of Rosavin and Salidroside in Compound Rosavin Rapidly Disintegrating Oral Tablets by RP-HPLC

ZHOU Xiao-ming，YAO Min-na，CAO Jin-yi，DING Yu，ZHAO Mei，TANG Hai-feng
（Dept.of Pharmacy，Xijing Hospital of Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，China）
ZHOU Xiao-ming
（No.94162of Chinese People’s Liberation Army，Xi’an 710614，China）

OBJECTIVE：To establish the method for the content determination of rosavin and salidroside in Compound rosavin rapidly disintegrating oral tablets.METHODS：RP-HPLC method was adopted.The determination was performed on Agilent TC-C18（250mm×4.6mm，5μm）column with mobile phases consisted of 0.2%phosphoric acid-acetonitrile（86∶14）for rosavin and methanol-water（15∶85）for salidroside at flow rate of 1.0mL·min-1.The detection wavelength was set at 254nm and 275nm，and the column temperature was 35℃.RESULTS：The linear ranges of rosavin and salidroside were 0.08～1.60μg（r＝0.9998）and 0.80～8.00μg（r＝0.9993）.The average recoveries were 100.22%（RSD＝1.58%，n＝6）and 99.37%（RSD＝1.35%，n＝6），respectively.CONCLUSION：The method is simple，accurate specific and reproducible，and it is applicable for the quality control of Compound rosavin rapidly disintegrating oral tablets.

Compound rosavin rapidly disintegrating oral tablets；Rosavin；Salidroside；RP-HPLC；Content determination

#通訊作者：教授，博士。研究方向：天然藥化和新藥研發(fā)。電話：029-84775471。E-mail：natprod@163.com

R283.64；R927.2

A

1001-0408（2011）19-1780-03

Δ國家重大新藥創(chuàng)制基金專項課題（2009ZXJ09004-082）

＊碩士研究生。研究方向：天然藥化和新藥研發(fā)。電話：029-84775471-8036。E-mail：zhouming820405@gmail.com

2010-11-22

2011-03-14）