HPLC法同時(shí)測(cè)定黃海棠中山柰酚和槲皮素的含量Δ

張偉，于海林，宋艷麗，康文藝#

（1.黃河科技學(xué)院，鄭州市 450063；2河南大學(xué)中藥研究所，開(kāi)封市 475004）

HPLC法同時(shí)測(cè)定黃海棠中山柰酚和槲皮素的含量Δ

張偉1，2＊，于海林2，宋艷麗2，康文藝2#

（1.黃河科技學(xué)院，鄭州市 450063；2河南大學(xué)中藥研究所，開(kāi)封市 475004）

目的：建立同時(shí)測(cè)定黃海棠中山柰酚和槲皮素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Purospher Star RP-C18（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.025mol·L-1磷酸水溶液（60∶40），流速為1.0mL·min-1，柱溫為25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為370nm。結(jié)果：山柰酚、槲皮素進(jìn)樣量的線性范圍分別為0.0184～0.1288μg（r＝0.9998）、0.008～0.064μg（r＝0.9999）；二者的平均加樣回收率分別為97.12%（RSD＝1.03%，n＝6）、96.51%（RSD＝1.32%，n＝6）。結(jié)論：本方法靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于黃海棠的質(zhì)量控制。

黃海棠；高效液相色譜法；山柰酚；槲皮素；含量測(cè)定

藤黃科金絲桃屬植物黃海棠（Hypericum ascyronL.）又名紅旱蓮、湖南連翹等，為多年生草本植物，分布于我國(guó)東北地區(qū)及黃河、長(zhǎng)江和珠江流域。民間將其廣泛用于止痛、抗菌消炎、治療創(chuàng)傷等[1]。黃海棠的化學(xué)成分和藥理研究不是很多，已有的研究證明其有良好的抗炎鎮(zhèn)痛效果[2]；從中分離得到了黃酮、口山酮和間苯三酚衍生物等化合物[3～7]。山柰酚（kaempferol）和槲皮素（quercetin）為黃海棠中黃酮類主要成分，具有降壓、降血脂及抗腫瘤等作用[8～11]。有研究用分光光度法對(duì)黃海棠總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定[12]，該方法操作復(fù)雜且只能測(cè)定總黃酮含量。筆者在對(duì)該植物系統(tǒng)化學(xué)和藥理作用的研究中，首次采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定了黃海棠中山柰酚和槲皮素的含量，可為評(píng)價(jià)該藥材質(zhì)量及合理用藥提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-2010A型HPLC儀，包括CLAS-VP色譜工作站、UV-2010A檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、四元低壓梯度泵（日本島津公司）；KQ-500DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

甲醇為色譜純，水為高純水，其余試劑均為分析純；山柰酚、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（河南大學(xué)中藥研究所自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98%）；黃海棠全草于2006年6月采集于河南省欒川縣，由河南大學(xué)中藥研究所生藥教研室李昌勤副教授鑒定為藤黃科植物黃海棠H.ascyronL.，標(biāo)本存放于河南大學(xué)中藥研究所（No.06070103）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Purospher Star RP-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.025mol·L-1磷酸水溶液（60∶40）；流速：1.0mL·min-1；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：370nm；進(jìn)樣量：10μL。在此條件下，槲皮素、山柰酚與其他成分的分離度R＞1.5，保留時(shí)間適中，理論板數(shù)按山柰酚峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.山柰酚標(biāo)準(zhǔn)品；B.槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品；C.黃海棠；1.山柰酚；2.槲皮素Fig1 HPLC chromatogramsA.kaempferide control；B.quercetin control；C.H.ascyron；1.kaempfeide；2.quercetin

2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取山柰酚標(biāo)準(zhǔn)品2.3mg和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品1.0mg，加甲醇制成每1mL含山柰酚0.0092mg和槲皮素0.0040mg的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

將干燥的黃海棠全草粉碎，過(guò)60目篩，精密稱取粉末40.0mg，置10mL容量瓶中，精密加入50%甲醇水溶液8mL，靜置12h，超聲（功率：500W，頻率：80kHz）提取 20min，放冷，定容至10mL，搖勻，以微孔濾膜（0.45μm）過(guò)濾，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取槲皮素和山柰酚混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得山柰酚的回歸方程為Y＝3×106X－1498.2（r＝0.9998），進(jìn)樣量的線性范圍為0.0184～0.1288μg；槲皮素的回歸方程為Y＝4×106X－199.3（r＝0.9999），進(jìn)樣量的線性范圍為0.008～0.064μg。

2.5 精密度試驗(yàn)

取山柰酚和槲皮素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果，山柰酚和槲皮素峰面積的RSD分別為0.38%和1.19%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取室溫放置的同一批號(hào)的黃海棠供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、10、12h進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果，山柰酚和槲皮素峰面積的RSD分別為1.68%和1.03%（n＝7），表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批號(hào)樣品6份，每份40mg，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果，山柰酚和槲皮素峰面積的RSD分別為1.29%和1.44%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知山柰酚和槲皮素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的黃海棠粉末20mg，置于10mL容量瓶中，平行6份，分別加入等量山柰酚和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果分別見(jiàn)表1、表2。

表1 山柰酚的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab1 Results of recovery test of kaempferol（n＝6）

表2 槲皮素的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab2 Results of recovery rate of quercetin（n＝6）

2.9 樣品含量測(cè)定

取不同批次樣品，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述方法測(cè)定黃海棠中山柰酚和槲皮素的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 黃海棠中槲皮素與山柰酚的含量測(cè)定結(jié)果（g·g-1，n＝3）Tab3 Content determination of quercetin and kaempferide in H.ascyron（g·g-1，n＝3）

3 討論

3.1 流動(dòng)相條件的選擇

在選擇分離條件時(shí)，曾選用甲醇-0.025mol·L-1磷酸水溶液和乙腈-0.025mol·L-1磷酸水溶液等[13，14]不同系統(tǒng)進(jìn)行洗脫，結(jié)果表明，甲醇與磷酸水的體積比為60∶40、流速為1.0mL·min-1時(shí)分離效果最佳，山柰酚和槲皮素與其相鄰峰的分離度＞1.5，符合定量分析要求，且保留時(shí)間較短，分析較快。

3.2 提取條件的選擇

山柰酚和槲皮素溶于含水的醇，在此基礎(chǔ)上考察了體積分?jǐn)?shù)分別為25%、50%、75%、100%的甲醇水溶液的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇水溶液提取率最高。在50%甲醇水溶液提取的基礎(chǔ)上，又考察了提取時(shí)間10、20、30、40min，結(jié)果顯示在20min時(shí)已經(jīng)提取完全，因此采用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇水溶液，提取20min。

本試驗(yàn)首次建立了同時(shí)測(cè)定黃海棠中山柰酚和槲皮素含量的方法。該方法靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于黃海棠藥材的質(zhì)量控制。

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Content Determination of Kaempferol and Quercetin inHypericum ascyronby HPLC

ZHANG Wei
（Huanghe College of Science and Technology，Zhengzhou 450063，China）
ZHANG Wei，YU Hai-lin，SONG Yan-li，KANG Wen-yi
（Institute of Chinese Materia Medica，Henan University，Kaifeng 475004，China）

OBJECITVE：To establish the method for the content determination of kaempferol and quercetin inHypericum ascyron.METHODS：HPLC method was adopted.The separation was performed on Purospher Star RP-C18（250mm×4.6mm，5μm）column with mobile phase consisted of methanol-0.025mol·L-1phosphate（60∶40）at flow rate of 1.0mL·min-1.The column temperature was 25℃ and determination wavelength was set at 370nm.RESULTS：The linear ranges of kaempferol and quercetin was 0.0184～0.1288μg（r＝0.9998）and 0.008～0.064μg（r＝0.9999）.The average recoveries were 97.12%（RSD＝1.03%，n＝6）and 96.51%（RSD＝1.32%，n＝6）.CONCLUSION：The method is sensitive，accurate，and reproducible for the simultaneous determination of kaempferol and quercetin inH.ascyron.

Hypericum ascyron；HPLC；Kaempferol；Quercetin；Content determination

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2011）19-1790-03

Δ河南省科技廳重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（102102310019）

＊講師，碩士研究生。研究方向：中藥活性成分。電話：0371-66607902。E-mail：zzzwwwqq@126.com

#通訊作者：教授。研究方向：中藥活性成分及新藥研發(fā)。電話：0378-3880680。E-mail：kangweny@hotmail.com

2011-02-28

2011-03-29）