大腸桿菌SOD高產(chǎn)菌的誘變選育及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

丁林

(沈陽(yáng)化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110142)

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase簡(jiǎn)稱(chēng)SOD，EC 1.15.1.1)是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種金屬酶，在生物體內(nèi)作為一種超氧化物陰離子清除劑而起著重要的作用.超氧陰離子與人類(lèi)及動(dòng)植物的機(jī)體衰老、腫瘤發(fā)生和自身免疫性疾病等有關(guān)，由于SOD能專(zhuān)一清除超氧陰離子，因此，它可以防御超氧陰離子的毒性，維持細(xì)胞正常的生理代謝，對(duì)機(jī)體具有抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、抗缺血、提高免疫力等保護(hù)作用，被專(zhuān)家稱(chēng)為21世紀(jì)最有前途的藥用酶.在醫(yī)藥、食品、日化產(chǎn)品等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用前景［1－3］.

目前SOD產(chǎn)品主要從動(dòng)物血液及臟器中提取，容易受原料價(jià)格和血源外源性感染的非安全性等因素限制，無(wú)法大量生產(chǎn)和被廣泛使用.而微生物資源豐富，易于大量培養(yǎng)，還可通過(guò)選育優(yōu)良菌種來(lái)提高產(chǎn)酶率［4］，是生產(chǎn)SOD的最好原料.國(guó)內(nèi)外有關(guān)微生物SOD研究報(bào)道較多的是酵母菌、霉菌，而有關(guān)細(xì)菌SOD的研究報(bào)道較少［5－6］.紫外線誘變育種是常用的育種方法，具有簡(jiǎn)便、快速和高效的特點(diǎn)，是菌種選育中最常采用的技術(shù)手段.故本文以大腸桿菌為出發(fā)菌株，通過(guò)紫外線誘變育種篩選出SOD高產(chǎn)菌株，以該菌株作為目的菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)制備SOD，并對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化.旨在為生產(chǎn)SOD提供新原料.

1 材料和方法

1.1 出發(fā)菌株

大腸桿菌(Escherichia coli)，我院微生物實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂20.121℃滅菌20 min.

分離培養(yǎng)基:滅菌的斜面培養(yǎng)基加過(guò)氧化氫8 g/L.

種子培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏6，蛋白胨10，NaCl 5.121℃滅菌20 min.

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏5，蛋白胨15，NaCl 5，葡萄糖3.121℃滅菌20 min.

1.3 誘變育種［7］

將活化的出發(fā)菌株接入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(約6 h).3 000 r/min離心15 min，棄上清液，菌體用生理鹽水洗滌2次后，制成菌數(shù)約為108個(gè)/mL的單細(xì)胞菌懸液.取菌懸液4 mL加到直徑6 cm的培養(yǎng)皿(內(nèi)裝攪拌子)內(nèi)，在15 W紫外線下30 cm處振動(dòng)照射不同時(shí)間.

1.4 初篩與復(fù)篩

將誘變處理后的菌液在避光下稀釋?zhuān)?.1 mL稀釋菌液涂布于平板分離培養(yǎng)基上，用黑紙包好，37℃培養(yǎng)24 h，與未經(jīng)照射處理的作對(duì)照，選取生長(zhǎng)飽滿(mǎn)的單個(gè)菌落編號(hào)，轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h.取斜面培養(yǎng)物接種于裝發(fā)酵培養(yǎng)基60 mL的250 mL三角瓶中，37℃搖瓶培養(yǎng)12 h，得培養(yǎng)液.然后制得粗酶液，測(cè)酶活.按酶活高低作為篩選目的菌株的依據(jù).對(duì)目的菌株進(jìn)行傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，并對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化.

1.5 酶的提取［8］

將上述得到的培養(yǎng)液，在4℃、12 000 r/min下冷凍離心15 min，收集菌體，稱(chēng)質(zhì)量，按料液比1∶5(g∶mL)的比例加入pH=7.2的磷酸緩沖液，冰浴下進(jìn)行超聲波破碎，冷凍離心，上清液即為粗酶液，測(cè)定酶活.

1.6 酶活力的測(cè)定［9］

用NBT光還原法測(cè)定.核黃素在光照時(shí)產(chǎn)生氧自由基，可將NBT還原成藍(lán)色甲腙(最大吸收波長(zhǎng)為560 nm)，而超氧化物歧化酶可清除氧自由基，抑制NBT還原反應(yīng).采用抑制50% NBT光還原的酶量為一個(gè)酶活單位，酶活力以每小時(shí)每克濕菌體的酶活單位數(shù)表示.

1.7 生物量的測(cè)定

按1.4操作得培養(yǎng)液，測(cè)量培養(yǎng)液體積，冷凍離心后，蒸餾水洗滌菌體，再離心，收集菌體，稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算生物量.

1.8 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

將目的菌株在固體斜面培養(yǎng)基上活化，接入種子培養(yǎng)基，于37℃振蕩培養(yǎng)12 h，得種子液，備用.

1.8.1 裝液量對(duì)產(chǎn)酶影響的實(shí)驗(yàn)

250 mL三角瓶裝入30 mL、60 mL、90 mL、120 mL的pH值為7.2的發(fā)酵培養(yǎng)基，按2.5%的接種量接入種子液，于37℃搖床培養(yǎng)16 h，按1.5操作制得粗酶液，測(cè)酶活，確定最佳裝液量.

1.8.2 接種量對(duì)產(chǎn)酶影響的實(shí)驗(yàn)

250 mL三角瓶裝液量60 mL，初始pH值為7.2，接種量(體積分?jǐn)?shù)，以下同)分別為2%、2.5%、3%、3.5%，于37℃搖床培養(yǎng)16 h，按1.5操作制得粗酶液，測(cè)酶活，確定最佳接種量.

1.8.3 培養(yǎng)基起始pH值對(duì)產(chǎn)酶影響的實(shí)驗(yàn)

配制不同pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌，分別取60 mL裝入250 mL三角瓶中，接種量為2.5%，于37℃搖床培養(yǎng)16 h，按1.5操作制得粗酶液，測(cè)酶活力，確定最佳起始pH值.

1.8.4 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶影響的實(shí)驗(yàn)

250 mL三角瓶裝液量60 mL，初始pH為7.2，接種量為2.5%，于不同溫度下?lián)u床培養(yǎng)16 h，按1.5操作制得粗酶液，測(cè)酶活，確定最佳培養(yǎng)溫度.

1.8.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響實(shí)驗(yàn)

250 mL三角瓶裝液量60 mL，初始pH為7.2，接種量為2.5%，于37℃搖床培養(yǎng)不同時(shí)間，按1.5操作制得粗酶液，測(cè)酶活力，確定最佳培養(yǎng)時(shí)間.

2 結(jié)果與討論

2.1 SOD高產(chǎn)菌株的選育

2.1.1 SOD高產(chǎn)菌株的篩選

將紫外線誘變處理后的抗過(guò)氧化氫菌株，按1.4～1.7操作測(cè)酶活和生物量，結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 SOD高產(chǎn)菌株的選育結(jié)果Table 1 The results of the breeding of SOD highproducing strain from Escherichia coli

從表1中可以看出:經(jīng)誘變篩選后得到的耐受過(guò)氧化氫的菌株的菌體生物量和SOD酶活均高于出發(fā)菌株，其中ECM3菌株最高，酶活比出發(fā)菌株高2.1倍，選用ECM3菌株作為目的菌株進(jìn)行發(fā)酵條件的研究.

2.1.2 菌株穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

將誘變后篩選得到的目的菌株連續(xù)培養(yǎng)5代，測(cè)菌體生物量和酶活，結(jié)果見(jiàn)表2.由表2可見(jiàn):目的菌株經(jīng)5次轉(zhuǎn)接傳代，SOD酶活仍比較穩(wěn)定，說(shuō)明其性狀可以得到穩(wěn)定遺傳.

表2 穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of stability experiments

2.2 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.2.1 裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響

裝液量對(duì)產(chǎn)酶影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3.由表3可知:250 mL三角瓶裝液量60 mL時(shí)酶活最高，所以最佳裝液量為60 mL.

表3 裝液量對(duì)SOD酶活的影響Table 3 The effect of liquid content on activity of SOD

2.2.2 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

接種量對(duì)產(chǎn)酶影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4.由表4可知:接種量2.5%時(shí)酶活最高.所以最佳接種量為2.5%.

表4 接種量對(duì)SOD酶活的影響Table 4 The effect of inoculation content on activity of SOD

2.2.3 培養(yǎng)基起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基起始pH值對(duì)產(chǎn)酶影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5.由表5可知:起始pH值為7.2時(shí)酶活最高.所以最佳起始pH值為7.2.

表5 pH值對(duì)SOD酶活的影響Table 5 The effect of pH value on activity of SOD

2.2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6.由表6可知:培養(yǎng)溫度在37℃時(shí)酶活力最高.所以最佳培養(yǎng)溫度為37℃.

表6 培養(yǎng)溫度對(duì)酶活的影響Table 6 The effect of tempertature on activity of SOD

2.2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7.由表7可知:培養(yǎng)時(shí)間16 h酶活力最高.所以最佳培養(yǎng)時(shí)間為16 h.

表7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)SOD酶活的影響Table 7 The effect of fermentation time on activity of SOD

2.2.6 最佳培養(yǎng)條件的重復(fù)實(shí)驗(yàn)

在最佳裝液量、接種量、溫度、起始pH和最佳培養(yǎng)時(shí)間條件下做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定酶活力，結(jié)果見(jiàn)表8.由表8可以看出:最佳發(fā)酵條件下制得的 SOD的酶活力平均值為 4 437.4 (U/g·h)，酶活力最大，重復(fù)性很好.

表8 最佳培養(yǎng)條件下的重復(fù)實(shí)驗(yàn)Table 8 Repetition test of optimal fermentation condition

3 結(jié)論

采用紫外誘變處理，經(jīng)考察抗過(guò)氧化氫能力進(jìn)行初篩和液態(tài)發(fā)酵測(cè)酶活力進(jìn)行復(fù)篩，得到了產(chǎn)SOD較高的目的菌株ECM3.并對(duì)該菌株進(jìn)行了一系列液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化，得到產(chǎn)酶最高的發(fā)酵條件為:250 mL三角瓶裝液量60 mL，接種量2.5%(體積分?jǐn)?shù))，培養(yǎng)基起始pH值為7.2，培養(yǎng)溫度為37℃，時(shí)間為16 h.在此條件下，SOD酶活力為4 435.5 U/g·h.上述結(jié)果對(duì)利用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)SOD的工業(yè)化具有一定的指導(dǎo)借鑒作用，并為研究大腸桿菌SOD形成的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).

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