γ-突觸核蛋白的克隆、表達及純化

劉曉娟 張力青 李 健 翟方麗 李慎濤，2*

(1.首都醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系;2.首都醫科大學基礎醫學院免疫學系; 3.清華大學第一附屬醫院華信醫院檢驗科)

1997年，Ji H等［1］通過cDNA直接差異測序法(direct-differential cDNA sequencing)分析克隆發現了一種新的基因——乳腺癌特異性基因1(breast cancer-specific gene 1，bcsg1)。該基因在乳腺癌cDNA文庫中高表達，而在正常乳腺中幾乎不表達［1］。它與神經蛋白突觸核蛋白家族成員具有高度的同源性，其后證實它與從腦基因文庫和cDNA文庫分離的γ-突觸核蛋白基因及persyn是同一基因，是突觸核蛋白家族的第3個成員［2］。突觸核蛋白是一個廣泛分布于中樞神經系統突觸前成分內的小分子可溶性蛋白質家族，由α-突觸核蛋白(SNCA)、β-突觸核蛋白(SNCB)和γ-突觸核蛋白(SNCG)3個成員組成，是一組氨基酸序列及結構高度同源的天然伸展蛋白。目前，對于它們的生物學功能還未充分了解，有研究［3］表明它們與神經系統的發育及某些神經退行性疾病相關。

γ-突觸核蛋白的異常表達與多種腫瘤的發生、發展有關，包括女性激素敏感性乳腺癌、卵巢癌，男性激素敏感性前列腺癌，消化系統腫瘤如食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌，以及肺癌、膀胱癌等［4－5］。雖然γ-突觸核蛋白在各種腫瘤中的陽性率不同，但它們有個共同特點，除食管癌外，γ-突觸核蛋白表達水平具有明顯的期別相關性特征，即隨病期進展，其表達率及表達強度漸增［6］。

人γ-突觸核蛋白與小鼠和大鼠γ-突觸核蛋白的一致性分別為87.7%和83.8%，與α-突觸核蛋白、β-突觸核蛋白和 synoretin的一致性分別為54%、56%和84%［7］。突觸核蛋白家族序列具有高度相似性，都由一個氨基端脂質結合區域、一段11個殘基的重復序列和一個酸性羧基末端組成［8］。氨基末端高度保守，在羧基末端，γ-突觸核蛋白與α、β-突觸核蛋白不同，缺乏2個16個殘基的串聯重復序列，僅保留了其強酸性的特點。高度保守的氨基端在脂質相互作用中起重要作用，強酸性的羧基末端具有類似分子伴侶活性的作用，介導蛋白質-蛋白質相互作用。突觸核蛋白蛋白家族各成員結構的差異也將引起彼此間功能的差異，繼而導致其在各種疾病中的不同作用［9］。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

人腦cDNA文庫由清華大學醫學院楊茂君教授惠贈;原核表達載體pGEX-6p-1、大腸桿菌克隆菌株DH5α及表達菌株BL21(DE3)均為本實驗室保存; DNA聚合酶、各種限制性內切酶和T4 DNA連接酶購自NEB公司;DNA片段膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自Omega公司;Glutathione SepharoseTM4B購自Amersham公司;Sephadex G25、Superdex 75 Hiload 16/ 60和Resource Q預裝柱購自GE公司。引物合成及DNA測序由上海生工公司完成，Phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)，二硫基蘇糖醇(DTT)，異丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)均購自Sigma公司;胰蛋白胨和酵母提取物(LB)購自Oxoid公司;其他常用化學試劑均為分析純，購自北京現代東方精細化學品有限公司。

制冷恒溫搖床(Thermo公司);超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司，JY92-2D);電泳儀(BIO-RAD，PowerPac3000);高速離心機(BECKMAN J2-HS);凝膠成像處理系統(GE healthcare ImageQuant 300);AKTA purifier蛋白純化系統(GE公司);MALDI-TOF質譜儀(PE公司)。

1.2 方法

1)目的基因片段的擴增:根據GenBank報道的γ-突觸核蛋白(NM_003087)序列，設計特異性引物，分別添加BamHI和XhoI酶切位點。以人cDNA文庫為模板，PCR擴增γ-突觸核蛋白的編碼序列。將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

2)克隆及鑒定:將擴增的PCR產物用BamHI和XhoI雙酶切，回收酶切后的片段，與經過同樣雙酶切的載體pGEX-6p-1按5:1摩爾比混合，在T4 DNA連接酶作用下于16℃連接過夜，用連接產物轉化Ecoli DH5α，涂布到含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB平板上，于37℃培養過夜，次日，從LB平板上隨機挑取5個菌落，接種于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB培養基中，于37℃培養16 h，提取質粒，進行PCR鑒定，將PCR鑒定為陽性的質粒再進行酶切鑒定，將酶切鑒定為陽性的質粒測序。

3)誘導表達分析:用測序正確的質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，隨機挑取5個菌落，接種于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB培養基中，于37℃培養過夜，次日，按1∶100的比例將過夜培養物轉接到5 mL含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養基中，于37℃培養，當培養液OD600值達到0.6～0.8時，加入IPTG(終濃度1 mmol/L)，誘導表達8～12 h，5 000 r/ min離心15 min收集菌體，取適量菌體用SDS-PAGE分析蛋白表達情況。

4)蛋白表達條件的優化及表達形式分析:分別對在不同溫度、不同IPTG終濃度、培養液的不同OD600值及不同表達時間4種條件下誘導后的菌體取樣進行SDS-PAGE，確定目標蛋白的最佳表達條件。在最佳表達條件下誘導目標蛋白表達，4 000 r/min離心15 min收集菌體，用 PBS(140 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4·12H2O、1.8 mmol/ L KH2PO4)重懸菌體，4 000 r/min離心15 min，收集菌體，用PBS重懸菌體，加入溶菌酶(終濃度至1 mg/ mL)、DTT及PMSF(終濃度至1 mmol/L)，冰上作用30 min后，在冰浴上超聲至菌體完全裂解，15 000 r/ min離心50 min，上清和沉淀分別取樣進行 SDSPAGE，確定目標蛋白的表達形式。

5)γ-突觸核蛋白重組蛋白的誘導表達:將γ-突觸核蛋白工程菌接種于40 mL含氨芐青霉素(100 μg/ mL)的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜，次日，按1∶100的體積比轉接于1 L含氨芐青霉素(100 μg/ mL)的LB液體培養基中，于37℃培養，當培養液OD600值達到0.8時，加入IPTG(終濃度0.4 mmol/ L)，于30℃下誘導表達11 h，5 000 r/min離心15 min收集菌體用于目標蛋白的純化。

6)γ-突觸核蛋白的純化:將誘導表達的菌體用超聲波破菌，離心收集上清，加到已用PBS平衡的Glutathione SepharoseTM4B親和層析柱上，讓其自然通過柱，然后用PBS洗滌雜蛋白，用酶切緩沖液(25 mmol/ L Tris、200 mmol/L NaCl、2 mmol/L DTT，pH 7.5)平衡柱，加入200 μL(1 mg/mL)PreScission蛋白酶，于4℃酶切過夜。次日，用洗脫緩沖液(25 mmol/L Tris-HCL、200 mmol/L NaCl、2 mmol/L DTT，pH 7.5)洗脫，收集穿過的蛋白樣品，用15%的SDS-PAGE鑒定。

收集蛋白，用Sepherdex G25柱脫鹽，緩沖液用陰離子交換A液(25 mmol/L Tris、50 mmol/L NaCl、2 mmol/L DTT，pH 8.0)，隨后將脫鹽后的蛋白樣品過Resource Q陰離子交換柱，所用緩沖液為:A液(25 mmol/L Tris、50 mmol/L NaCl、2 mmol/L DTT，pH 8.0)、B液(25 mmol/L Tris、1 mol/L NaCl、2 mmol/L DTT，pH 8.0)。收集含有蛋白質的組分，用 SDSPAGE鑒定，將含有目標蛋白質的組分合并，用濃縮管濃縮至適當的體積，加至Superdex 75 Hiload 16/60柱上，進行凝膠過濾純化，所用緩沖液為凝膠過濾緩沖液(25 mmol/L Tris、200 mmol/L NaCl、2 mmol/L DTT，pH 8.0)。利用AKTA純化儀隨機軟件對洗脫峰進行積分并估算蛋白質濃度。

7)目標蛋白的質譜分析:從SDS-PAGE膠上切取含有目標蛋白質的膠點，經還原烷基化消化后，用MALDI-TOF質譜儀進行肽質量指紋圖譜(Peptide mass fingerprinting，PMF)分析。運用Mascot軟件對PMF的結果與NCBI中的蛋白質庫的理論圖譜進行比較和評價，得出蛋白質的可能性分數，根據所用蛋白數據庫來確定陽性的分數，從而判定是否為γ-突觸核蛋白。

2 結果

2.1 γ-突觸核蛋白表達載體的構建

PCR擴增得到了編碼γ-突觸核蛋白的DNA片段，經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大小與預期的一致。將該片段和pGEX-6p-1載體連接后，轉化大腸桿菌DH5α，挑取單菌落，經菌液PCR鑒定得到陽性克隆，經質粒酶切鑒定，得到陽性克隆，測序結果證實為γ-突觸核蛋白編碼序列。

2.2 誘導表達分析

γ-突觸核蛋白工程菌在37℃、1 mmol/L IPTG的條件下誘導表達8～12 h，在破菌沉淀中可見相對分子質量約為39 000的特異性蛋白質表達條帶，大小與預期的一致。

2.3 蛋白表達條件的優化

1)在培養液 OD600值等于0.8、IPTG濃度0.5 mmol/L條件下，分別在16℃、23℃、30℃及37℃誘導菌體表達目標蛋白，于誘導后7 h取樣進行SDS-PAGE，結果表明30℃時目標蛋白的表達量最大(圖1)。

圖1 目標蛋白在不同溫度下誘導后的SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE analysis of target protein induced with IPTG at different temperature1：before induction;2：16℃;3：23℃;4：30℃;5：37℃;M：96 000，66 000，46 000，34 000，26 000;IPTG：isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside.

2)在培養液OD600值等于0.8、30℃條件下，用終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L的IPTG誘導菌體表達目標蛋白，于誘導后7 h取樣SDS-PAGE，結果表明當IPTG終濃度為0.4 mmol/L時目標蛋白的表達量最大(圖2)。

圖2 目標蛋白在不同濃度IPTG誘導后的SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE analysis of target protein induced with different final concentration of IPTG1：before induction;2：0.1 mmol/L IPTG;3：0.2 mmol/L IPTG;4：0.3 mmol/L IPTG;5：0.4 mmol/L IPTG;6：0.5 mmol/L IPTG;7：0.6 mmol/L IPTG;8：0.7 mmol/L IPTG; M：96 000，66 000，46 000，34 000，26 000，16 000; IPTG：isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside.

3)在培養液OD600值等于0.8、30℃、IPTG終濃度為0.4 mmol/L條件下誘導菌體表達目標蛋白，于誘導后1 h、3 h、5 h、7 h、9 h、11 h、13 h取樣SDS-PAGE，結果表明誘導后11 h目標蛋白的表達量最大(圖3)。

4)在IPTG終濃度為0.4 mmol/L、30℃誘導條件下，在培養液OD600值分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2時誘導菌體表達目標蛋白，于誘導后7 h取樣SDSPAGE，結果表明當培養液OD600值為0.8時目標蛋白的表達量最大(圖4)。

圖3 目標蛋白在誘導后不同時間的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE analysis of target protein induced with IPTG for different time1：Before induction;2：1 h;3：3 h;4：5 h;5：7 h;6：9 h; 7：11 h;8：13 h;M：96 000，66 000，46 000，34 000，26 000，16 000;IPTG：isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside.

由上述實驗可知，γ-突觸核蛋白在大腸桿菌中的最佳表達條件為:培養溫度30℃、培養液OD600值等于0.8、IPTG終濃度0.4 mmol/L、誘導時間11 h。

2.4 蛋白表達形式分析

在最佳表達條件下誘導菌體表達目標蛋白后，用超聲完全裂解菌體，SDS-PAGE表明，上清中含有大量目標蛋白，說明γ-突觸核蛋白在大腸桿菌中可溶性表達。

2.5 蛋白純化

將收集的菌體破碎、離心后，收集上清，進行Glutathione SepharoseTM4B親和層析純化，得到較高純度的目的蛋白。利用陰離子交換進一步純化目標蛋白，收集主峰各組分。合并后經電泳鑒定，得到較高純度的目的蛋白(圖5)。將含有目標蛋白的組分合并，用濃縮管濃縮至0.5 mL，再用分子篩層析進行進一步純化，得到純度較好的目標蛋白(圖6)。

圖6 分子篩純化圖及SDS-PAGE結果Fig.6 Purification profile of human synuclein gamma by Superdex 75 column and analysis by SDS-PAGEA：Purification profile on Superdex 75 Hiload 16/60;B：SDS-PAGE;1：fraction A3 of gel filtration; 2：fraction A4 of gel filtration;M：116 000，66 200，45 000，25 000，18 400，14 400.

2.6 蛋白的質譜鑒定

將樣品SDS-PAGE膠點消化后，進行質譜分析表明，經數據庫搜索，該蛋白與蛋白質庫中γ-突觸核蛋白的可能性分值為90。從蛋白水平證實該蛋白為γ-突觸核蛋白(圖7)。

3 討論

圖7 蛋白的質譜分析結果Fig.7 The result of mass spectrography

γ-突觸核蛋白作為一種全新的基因，因其獨特的表達特點和病理機制正受到越來越多的關注。它在神經退行性疾病、視覺組織、嗅覺組織的一些病理狀態和腫瘤發生發展過程中起作用。γ-突觸核蛋白是一種提示腫瘤惡性表型和不良預后的分子標志物，在腫瘤分期、早期診斷、治療中有重要作用。隨著對該基因研究的逐步深入，它有可能成為某些腫瘤治療的全新分子靶點，指導設計最優化和個性化的治療方案，開發新藥，逆轉腫瘤惡化，改善預后，為腫瘤的攻克提供一個新的方向。但對其的研究工作僅得到一些初步結果，其在各種疾病中的功能仍需進一步探究。

本研究已成功地在大腸桿菌中表達了γ-突觸核蛋白，并建立了純化工藝，目前正在進行γ-突觸核蛋白的晶體學及功能研究，試圖從結構生物學的角度闡明γ-突觸核蛋白的功能。

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