HIV Nef的結構特點及生物學作用

張宏偉 吳 昊

(首都醫科大學附屬北京佑安醫院感染科)

負調控因子(negative factor，Nef)作為人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)附屬蛋白之一，其基因在靈長類慢病毒，即HIV-1，HIV-2和猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)中高度保守，表達于病毒生活周期的早期。早期研究［1－3］表明，該基因的蛋白產物對病毒復制具有抑制作用，因而得名為“負性因子”或Nef。但隨著研究的深入人們發現，Nef能夠增強病毒的復制能力和感染性，促進艾滋病病情的進展［4－5］。本文對于Nef的結構特點及生物學作用進行綜述如下。

1 Nef蛋白的結構特點

HIV Nef蛋白是相對分子質量為25 000～34 000的豆蔻酰化蛋白，存在于細胞質和細胞膜上［6］。目前尚未發現Nef蛋白具有酶活性。大量研究［7－9］顯示，Nef具有一些保守模體，這些模體可與細胞因子發生相互作用。因而，Nef具有銜接蛋白的功能，通過蛋白-蛋白之間的多重相互作用調節細胞的信號轉導。

Nef的柔韌性相對較大，具有較大的溶劑暴露面和一些無序區。正是由于這些特點，很難獲得Nef蛋白全長序列的精確三維結構。然而，采用X線晶體學以及磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)的方法，Nef的球形核心結構域(第54～205位氨基酸殘基)已經被成功解構［10－11］，此外，運用NMR光譜分析技術，Geyer M等［7］又成功解析Nef蛋白氨基端錨定結構域的結構，除氨基端豆蔻酰化基團外，部分空間排列有序。基于這些構象解析，Geyer M等［12］設計出一種預測Nef蛋白全長序列的構象的模型。在此模型中，Nef表面由許多線性排列的蛋白-蛋白相互作用結構域組成，因此，具有較大的彈性。Nef的柔性使該蛋白能夠在多種構象間進行轉換，其構象依其所結合的對象而定。

2 Nef的生物活性

2.1 Nef對主要組織相容性復合體I(major histocompatibility complexⅠ，MHCⅠ)功能的影響

在1989年，兩項研究［13－14］先后報道了在HIV感染的T細胞中MHCⅠ下調的現象。7年后，Schwartz O及其同事［15］發現，HIV-1 Nef是引起這一效應的附屬蛋白。突變研究［8］顯示，破壞Nef的含有蛋氨酸殘基(R17ERM20RRAEPA26)的兩親性 α-螺旋、酸性區(E62-65)或多聚脯氨酸螺旋(P69/72/75/78)可降低它在MHCⅠ轉運方面的活性，阻斷Nef與MHCⅠ細胞質尾部結構域的結合。

HIV Nef降低MHC-Ⅰ中人類白細胞抗原A、B (human leukocyte antigens-A、B，HLA-A、HLA-B)在感染細胞表面的表達，從而減少病毒抗原在HIV感染細胞表面的暴露，避免HIV感染的細胞被HIV特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)的識別和殺傷［16］。HIV Nef不影響HLA-C和HLA-E的表達［17］。這些分子向自然殺傷(natural killer cell，NK)細胞提供適當的抑制信號，以逃逸NK細胞的殺傷。因此，Nef可在適應性和先天性細胞免疫兩個方面保護HIV感染的細胞。

2.2 Nef對CD4的影響

CD4蛋白是HIV感染的輔助受體。由于細胞膜上存在的CD4可降低新生病毒顆粒出芽和離開感染細胞的能力，減少病毒的感染性，因此，HIV感染細胞后，細胞表面的CD4對病毒具有不利影響。HIV-1通過兩種蛋白即Vpu和Nef對抗這一效應［18］。目前認為，Nef對于CD4向細胞表面的轉運無顯著影響，但可明顯縮短細胞表面CD4分子的半衰期。

Nef的這一功能可能是通過與CD4細胞質尾部結合而實現的。NMR結構分析表明［9］，Nef核心結構域的疏水袋與CD4胞質尾部的13個氨基酸肽段(QIKRLLSEKKT)具有直接的相互作用。這一相互作用在體外相當弱(解離常數為1 mmol/L)，但十分特異，因為肽段中雙亮氨酸膜體的斷裂可以破壞這種作用［9］。有研究［19］表明，全長Nef與CD4細胞質尾部結構域形成的復合體更加穩定，解離常數約為0.5 mmol/L，由此提示，Nef蛋白氨基端其他的氨基酸也參與了與CD4的相互作用。然而，體內檢測到Nef與CD4的相互作用并不需要雙亮氨酸模體的參與，可能還有其他因素參與這種相互作用［20］。

Nef羧基端彈性袢中有3個結構域與Nef下調CD4的能力有關，即雙亮氨酸模體(EXXXLL165)和2個酸性模體(EE155和DD175)。雙亮氨酸模體和雙天門冬氨酸模體的作用已經明確，其中之一發生突變可完全破壞Nef的活性。

2.3 Nef介導的CD28下調

T細胞受體(T cell receptor，TCR)功能的發揮需要輔助分子如CD28所傳遞的輔助刺激信號。研究［21］表明，TCR或CD28與配體單獨結合僅能激活少量T細胞，造成一種無能狀態。除下調CD4以外，Nef也能夠加速輔助刺激分子CD28的內化。基因和功能研究［22］顯示，Nef介導的CD28內吞作用需要銜接蛋白2(adaptor protein 2，AP2)參與，由Nef，AP2和CD28直接相互作用所引起，Nef的這一作用是一種保守現象。Nef的LL165/166和His194殘基對于下調CD28具有關鍵作用。

CD28分子下調對于病毒的益處尚不明確，一種假說［22］認為，通過下調CD28，病毒能夠阻止T細胞激活。CD28和B7分子之間、TCR/CD4和MHCⅡ類分子之間的相互作用對于穩定和維持T細胞與抗原提呈細胞(antigen-presenting cells，APCs)間緊密而又持久的相互作用，具有十分重要的意義。Nef介導的C28和CD4下調可減弱T細胞與APC細胞之間的相互作用促進，感染的T細胞進入血液循環，以及向其他APC細胞運動，從而增強病毒的傳播［22］。此外，通過下調CD28，Nef可降低感染T細胞和APC之間的信號傳導或干擾正常的TCR啟動信號。此效應對于阻斷激活誘導的凋亡十分重要。由于Nef可激活特定的下游效因子如活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T-cells，NFAT)，替代正常信號級聯反應［22］，因而，盡管CD28被異常下調，但感染的細胞仍能維持于激活狀態，導致T細胞激活與抗原提呈脫節。

2.4 Nef介導的MHCⅡ類分子下調

MHCⅡ蛋白表達于所有抗原提呈細胞中，發揮向CD4+T細胞提呈抗原肽的作用。在慢性感染的單核細胞中，MHCⅡ抗原提呈受到阻礙，HIV-1 Nef可影響MHCⅡ蛋白在細胞表面的定位，減少外源性肽段向CD4+細胞的提呈［23］。

Nef蛋白通過兩種機制破壞MHCⅡ抗原提呈，其中包括下調成熟MHCⅡ在細胞表面的表達以及上調MHCⅡ相關的恒定鏈(invariant chain，Ii)在細胞表面的表達。與Ii的上調相比，成熟MHCⅡ的下調所需Nef的濃度較高［23］。雙亮氨酸模體(LL165/166)和酸性模體(EDE174～176)對于Nef誘導的CD4下調和Ii上調十分關鍵，75和78位脯氨酸突變可阻斷MHCⅠ和MHCⅡ下調，但對于Ii上調沒有影響［24］。這些結果揭示Nef下調MHCⅡ的詳細機制，這一功能在抑制病毒特異性T細胞免疫方面具有重要作用。

2.5 Nef對病毒感染性和復制能力的影響

研究［24］顯示，采用HeLa-CD4-LTR-β-半乳糖苷酶標志的細胞系感染試驗中，Nef+HIV-1比Nef-HIV-1感染的細胞多5～20倍;在單輪感染試驗中，Nef突變的原病毒DNA生產的病毒顆粒的感染性比野生型病毒株降低4～40倍。Nef缺陷株的傳染性可通過在產生病毒的細胞中加入表達Nef的質粒而得以加強。

Nef可通過增加宿主淋巴細胞數量而促進病毒復制。NFAT是一種在協調T細胞激活方面發揮重要作用的轉錄因子。據Manninen A等［25］報道，Nef可誘導產生NFAT的生成，Nef對于T細胞的這種作用為鈣/鈣神經素通路所調節，并與Ras通路相協同。在靜止的CD4+T淋巴細胞中，NFAT的異常表達可誘導出一種容許狀態，在這種狀態下，盡管缺少有關T細胞激活方面的證據，但HIV仍然可以在這些細胞中復制。

發動蛋白2對于Nef增加病毒感染性是必需的。據Massimo A等［26］報道，采用RNA干擾技術敲除發動蛋白2后可抑制Nef增加病毒感染性的能力。對于發動蛋白2敲除的細胞，外源性表達發動蛋白2可補救Nef的這一功能。Nef誘導的病毒感染性增加尚依賴于包涵素，因為在包涵素敲除的細胞或表達AP18的細胞中，Nef的這一功能明顯降低，甚至完全受到抑制。

2.6 Nef對細胞凋亡的影響

Nef可誘導感染的和未感染的免疫效應細胞發生凋亡。在感染的細胞中，Nef誘導HIV特異性細胞毒性T細胞(cytotoxiclymphocyte，CTL)自殺相關因子(factor associated suicide，Fas，CD95)和 Fas配體(CD95L)的表達，凋亡信號的激活導致HIV特異性CTL凋亡，從而出現免疫逃逸。Nef可通過c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和核因子-κB (nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號傳導通路誘導凋亡，氨基末端豆蔻酰化破壞或R106A突變后，Nef喪失誘導凋亡的能力［27］。

Nef可增強宿主細胞耐受Fas和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α介導的凋亡，改變病毒感染細胞的胞內微環境。HIV病毒可使感染T細胞表面FasL表達增加［28］，促進鄰近的CTL凋亡，從而保護感染的細胞。為了阻止FasL和TNF-α誘導感染的細胞發生未成熟死亡，Nef與細胞內凋亡信號調節激酶(apoptosis signal-regulating kinase，ASK1)結合，從而抑制Fas介導的細胞凋亡，保護感染細胞免于凋亡。

Nef也可通過Bad抑制死亡信號傳導，Bad是B細胞淋巴瘤/白血病2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)蛋白家族中促凋亡成員之一，其表達受HIV誘導，在線粒體水平調控細胞凋亡［29］。Nef介導的磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)和p21活化蛋白激酶(p21-activated protein kinases，PAK)激活可導致Bad磷酸化，引起抗凋亡蛋白Bcl-XL從Bad/Bcl-XL復合體中釋放出來，增加細胞的存活和病毒的復制［29］。

此外，Nef也可通過氨基末端(1～57位氨基酸殘基)直接結合腫瘤抑制因子P53，降低P53蛋白的半衰期、DNA結合能力及轉錄活性，從而抑制HIV-1感染的細胞發生P53介導的細胞凋亡。具體機制可能是通過激活P21激活的激酶和PI3K而阻止細胞凋亡通路。

3 結論

Nef作為HIV附屬蛋白之一，是相對分子質量較小的豆蔻酰化蛋白，Nef的柔韌性相對較大，具有一些保守模體，這些模體是Nef發揮多種功能的結構基礎。

Nef蛋白通過下調 CD4，MHCⅠ，MHCⅡ和CD28分子的表達，在對抗宿主免疫應答方面發揮重要作用。Nef在T細胞中可啟動轉錄，增強病毒的復制和感染性。Nef蛋白也通過抑制外源性和內源性死亡信號而促進感染細胞的存活。

在感染的細胞中Nef作為銜接蛋白募集信號傳導復合體，在HIV致病機制方面發揮關鍵作用。

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