基因重組型人SORL1蛋白質片段的原核表達和純化

李 爽李堯華* 葉懿文李 昕于 順楊 慧陳 彪

(1.首都醫科大學宣武醫院老年病研究所神經生物學研究室，教育部神經變性病重點實驗室，北京100053;2.首都醫科大學北京神經科學研究所，北京市神經再生修復研究重點實驗室，教育部神經變性病重點實驗室，北京100069)

含L(DLR類)A重復分揀蛋白相關受體〔sortilinrelated receptor，L(DLR class)A repeats-containing，SORL1〕是一種Ⅰ型跨膜蛋白，相對分子質量約為250000。在腦內，SORL1大量存在于海馬、齒狀回和大腦皮質的神經細胞內［1］。研究［2］顯示SORL1與淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)的加工、處理過程相關，如抑制SORL1的活性，神經元內就會產生更多數量的β淀粉樣蛋白。另外，sorl1基因多態性與阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)相關，特別是在散發性AD患者的腦脊液中發現SORL1蛋白表達水平明顯下降［3-4］。因此，普遍認為SORL1是繼載脂蛋白E ε4(apolipoprotein E epsilon 4，APOE ε4)之后發現的與散發性AD關系較為密切的風險因子之一［5］。本實驗將人sorl1 cDNA 5 923～6 260 bp片段亞克隆至原核表達載體，研究了sorl1 cDNA片段在原核細胞中的表達過程，制備了高純度基因重組人SORL1蛋白質片段，為制備抗SORL1抗體提供樣品保障。

1 材料和方法

1.1 材料

質粒pET-28a(+)為本實驗室保存;限制性核酸內切酶NcoⅠ和SalⅠ、DNA Ligation Kit購自大連寶生物工程有限公司;Gel Extracton Kit購自美國Omega公司;質粒小提試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;蛋白定量試劑盒(BCA protein assay Kit)購自美國Pierce公司;感受態細菌DH 5α和BL21(DE3)plysS購自北京鼎國生物公司。人sorl1 cDNA由美國加利福尼亞大學馬秋蘭教授惠贈。

1.2 引物設計及PCR擴增

參照Genebank中NM003105.4的mRNA序列設計上游引物序列為：5'-CGCCATGGTGGTCATCAAGTGGGAAT-3'，下游引物序列為：5'-CGCGTCGACTCACTCATAGCCCCTGCTT-3'。在兩引物中分別導入NcoⅠ和SalⅠ限制性核酸內切酶位點序列。以人sorl1 cDNA為模板，按照如下程序擴增目的DNA：95℃ 40 s，56℃ 40 s，72℃ 1 min，循環數為30。

1.3 重組表達質粒的構建

PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后回收其358 bp片段。把純化后的DNA片段和pET-28a(+)空載質粒分別經內切酶NcoⅠ和SalⅠ消化。將酶切后的PCR產物與線性pET-28a(+)回收，用DNA Ligation Kit在16℃下連接30 min，轉化至DH 5α感受態細菌中，涂布于含卡那霉素的LB固體培養基中，次日挑取單一菌落進行小培養，提取質粒并測序。

1.4 重組質粒的原核細胞表達

將重組質粒轉化至BL21(DE3)plysS感受態細菌，挑取單一菌落，接種至10 mL含卡那霉素的LB液體培養基中，37℃，230 r/min振蕩16 h。取2.5 mL培養液接種至250 mL含有卡那霉素(1∶1 000)的2× YTA培養基，37℃振蕩培養3 h后，加入異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖(isopropyl beta-D-thiogalactopy ranoside，IPTG)誘導轉化菌4 h。離心收集細菌沉淀，用預冷的Tris-HCl(20 mmol/L)-EDTA(1 mmol/L)懸浮，超聲破碎(工作2 s，間隔2 s，10 min)，離心(4℃，10 000 g，30 min)后SDS-PAGE分析。

1.5 包涵體的洗滌與溶解

包涵體組分分別用緩沖液Ⅰ(50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)、Ⅱ(緩沖液Ⅰ+1%Triton-X 100)和Ⅲ(緩沖液Ⅰ+2 mol/L尿素)4℃下洗滌30 min，離心(4℃，10 000 g，30 min)棄上清。加入緩沖液Ⅳ(緩沖液Ⅰ+8 mol/L尿素)，冰浴攪拌1 h，離心收集上清。

1.6 重組蛋白的純化

將溶解的包涵體組分應用 TSK-GEL G3000 SWXL色譜柱分離。流動相：50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，8 mol/L尿素，pH 8.0?；厥漳繕说鞍踪|組分，用PBS透析過夜。蛋白定量采用BCA法，以牛血清白蛋白為標準。

2 結果

2.1 人sorl1 cDNA 5 923～6 260 bp片段的擴增

PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離可見約358 bp大小。純化和回收擴增產物并與pET-28a(+)連接。對重組質粒測序結果證明，亞克隆的cDNA全長 358 bp，編碼 113個氨基酸，與 Genebank中NM003105.4的mRNA的5 923～6 260 bp區完全相同(圖1)。

圖1 人sorl1 cDNA片段核苷酸序列及編碼氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the human sorl1 cDNA fragmentsorl1：sortilin-related receptor，L(DLR class)A repeats-containing.

2.2 重組質粒的原核表達

重組質粒在BL21(DE3)plysS細菌中的表達量隨IPTG誘導的時間遞增，且存在于細菌的包涵體組分中(圖2)。

圖2 重組質粒在原核細胞中的表達Fig.2 Prokaryotic expression of PET-28a(+)-human sorl1 cDNA 5 923～6 260 bpEach sample(5 μL)was separated with SDS-PAGE and stained by coomassie brilliant blue R250.Lane 0～4：bacterial lysate，induced-time(0～4 h)with IPTG;Lane 5：the soluble fraction of bacterial lysate;Lane 6：the insoluble fraction of bacterial lysate(inclusion bodies fraction);Lane7：inclusion bodies dissolved in 8mol/L urea;Lane 8：the purified recombinant protein by column chromatography;M：protein standard molecular weight marker;sorl1：sortilin-related receptor，L(DLR class)A repeats-containing.

2.3 重組蛋白的純化

經8 mol/L尿素處理后的重組蛋白通過TSKGEL G3000 SWXL色譜柱的保留時間為18 min(圖3);純化的目的蛋白在SDS－PAGE上表現為單一條帶(圖2)。每500 mL細菌培養液可獲得重組蛋白約為24 mg。

圖3 重組蛋白的純化Fig.3 Purification of the recombinant proteinArrow：the peak of target protein separated by TSK-GEL G3000 SWXL column chromatography.

3 討論

SROL1是一個多區域蛋白，且與低密度脂蛋白受體同源，具有物質運輸、分子伴侶、信號轉導以及蛋白分選等多種生物學功能。雖然受到遺傳異質性的影響，但是包括中國漢族人群在內的多種族、多中心遺傳學研究［6-8］支持sorl1基因多態性與AD密切相關。APP的蛋白水解過程一直被認為是AD發病中心環節［9］。位于反面高爾基體網(trans-Golgi-network，TGN)的SORL1與調節蛋白共同作用調控APP的靶向運輸，阻止其進入β淀粉樣蛋白(amyloid protein β，Aβ)生成途徑［10］。過表達的SORL1可以引起APP重新分布到高爾基體，減少Aβ的產生，而在基因敲除小鼠模型中，APP的水解代謝增加、Aβ異常積聚，促進老年斑的形成［11-12］。另外，SORL1富含于腦內神經元，研究［13-14］顯示在散發性AD患者中，其神經細胞內的SORL1蛋白含量明顯減少，且與AD病理易損區(如海馬、顳葉大腦皮質)的淀粉數斑塊數量呈負相關。最重要的是，在伴有輕度認知障礙(mild cognitive impairment，MCI)的癥狀前 AD患者中同樣也發現SORL1蛋白水平已有下降，表明SORL1的病理性改變是散發性AD的早期事件，同時也是Aβ產生的始動因素［15-16］。因此，監測體內SORL1蛋白含量可能成為一種新的早期診斷散發性AD的生物標記物。

sorl1基因位于11q23.2-24.2，其cDNA包含一個6 639 bp的開放閱讀框，編碼2 214個氨基酸。本研究采用了基因工程技術重組了人sorl1基因片段，選用的載體是 pET-28a(+)原核表達載體。依據人sorl1 cDNA編碼氨基酸的親、疏水性先后選擇了3個親水性較強的候選片段，利用載體中NcoⅠ酶切位點中的起始密碼ATG序列設計引物。3個重組質粒測序證實閱讀框無誤后，SDS-PAGE結果顯示其中兩個重組質粒在大腸桿菌不表達(結果未展示)，只有pET-28a(+)-human sorl1 cDNA 5 923～6 260 bp在IPTG的誘導下，一個分子量約13 000的蛋白質開始表達并呈現時間依賴性遞增，而且表達的目標蛋白以包涵體的形式存在于細菌沉淀中。本課題組應用8 mol/L尿素溶解包涵體，并將其進行凝膠過濾層析、透析復性等處理，最后通過SDS-PAGE電泳鑒定，證實目的蛋白純化成功，為制備抗SORL1抗體并探討AD的發病機制奠定了基礎。

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