蒲黃黃酮對缺氧損傷血管內皮細胞的保護作用

林 潔 ，賈春燕 ，王若光 ，王 璇 ，肖艷娟 ，葉 贊

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學2007級研究生班，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；4.湖南中醫藥大學2006級研究生班，湖南 長沙 410208）

蒲黃黃酮對缺氧損傷血管內皮細胞的保護作用

林 潔1，賈春燕2，王若光3，王 璇4，肖艷娟4，葉 贊4

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學2007級研究生班，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；4.湖南中醫藥大學2006級研究生班，湖南 長沙 410208）

目的 研究蒲黃黃酮對缺氧損傷血管內皮細胞人臍靜脈內皮細胞（HUVE-12）活性、內皮素(ET)、一氧化氮(NO)含量的影響。方法 缺氧誘導血管內皮細胞損傷，MTT比色法觀察蒲黃黃酮對血管內皮細胞的影響，酶聯免疫法測定細胞培養液中內皮素－1（ET-1）、NO的含量。結果 蒲黃黃酮可提高缺氧時HUVE-12細胞活性，減少NO降低程度（P<0.05），抑制ET-1的生成（P<0.05），蒲黃黃酮對HUVE-12細胞的這種保護作用與其濃度存在一定的量效關系。結論 蒲黃黃酮對缺氧損傷的血管內皮細胞HUVE－12具有保護作用，其作用可能與NO和ET-1的生成有關。

蒲黃黃酮；血管內皮細胞；缺氧損傷；保護性作用

蒲黃，為香蒲科植物（Typhaceae）水燭香蒲、東方香蒲或其它同屬植物的花粉。具有活血化瘀、止血消腫、排膿生肌、通淋等功效。蒲黃歷來為眾多醫家用來治療婦科疾病如經期腹痛，產后出血，產后疼痛，且療效顯著，實為婦科良藥。前期研究中提示蒲黃黃酮具有雌激素樣效應，雌激素對血管內皮細胞的保護作用已經證實[1]，故本次實驗利用體外培養的方法來驗證蒲黃黃酮對血管內皮細胞保護作用，探明蒲黃黃酮保護血管內皮細胞的作用機制，進一步闡明蒲黃的類雌激素效應。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 蒲黃黃酮乙醇提取浸膏，生藥含量為1.6%，由湖南中醫藥大學藥學院制備提供。陽性對照藥17-β雌二醇，由美國Sigma公司提供。

1.1.2 細胞 人臍靜脈內皮細胞株HUVE-12，引自湘雅細胞中心。

1.1.3 儀器 全自動酶標儀（MK3）購自芬蘭LABSYSTEMS集團，紫外分光光度儀（UU-754）上海第三分析儀器廠，倒置顯微鏡（XDS-1B）購自重慶光學儀器廠。

1.1.4 試劑 DMEM培養基、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(MTT)，購于美國Sigma公司。小牛血清，購自湘雅細胞中心。二甲基亞砜(DMS0)，購于索萊寶科技有限公司。NO檢測試劑盒（南京建成科技有限公司），人內皮素1（ET-1）ELISA檢測試劑盒（RD）。

1.2 方法

1.2.1 HUVE-12細胞的培養及分組 將人臍靜脈內皮細胞HUVE-12培養于DMEM培養液中，其中含 10%小牛血清，青霉素 100 U／mL，鏈霉素100／mL，37 ℃，5%CO2培養箱中培養，按 2.5×104個細胞／孔的細胞密度接種于96孔板，繼續培養24 h，待HUVEC-12細胞生長呈亞融合狀態時分成6組，分別在不同條件下培養（n=5）即：蒲黃黃酮150μg/mL細胞組（簡稱高劑量組）、蒲黃黃酮100μg/mL細胞組（簡稱中劑量組）、蒲黃黃酮50μg/mL細胞組（簡稱低劑量組）、17-β雌二醇10-8mol/L細胞組（簡稱陽性對照組）、正常培養細胞組（簡稱正常組）、缺氧組（單純缺氧培養細胞，不加任何藥物干預）。

1.2.2 缺氧裝置的建立 參照文獻[2－3]的方法，將盛有HUVEC-12細胞的96孔培養板放入1個密閉的玻璃干燥器皿中，并在玻璃器皿中點燃1支蠟燭，立即蓋好玻璃器皿蓋，并用凡士林封口，待蠟燭熄滅后將玻璃器皿連同96孔培養板一同放入37℃，5%CO2培養箱中缺氧培養4 h。

1.2.3 血管內皮細胞毒性試驗 以MTT法檢測蒲黃黃酮對血管內皮細胞毒性。參照文獻[4]，以每孔2.5×104個/mL細胞濃度接種于96孔培養板中，用DMEM培養液配制成不同濃度的蒲黃黃酮藥液，實驗時棄去細胞培養液，分別向孔中加入不同濃度的藥液200 μL，每個濃度組設重復孔5個，空白對照組每孔加入200 μL不含ICA的DMEM培養液。37℃，CO2培養箱培養48 h。終止培養前每孔加入MTT(最終濃度0.5 mg／mL)，37 ℃，5%CO2培養4h。棄去上清液，每孔內加入DMSO 200 μL，靜置10 min。在酶標儀570 nm下測定各孔吸光度值。

1.2.4 內皮細胞抑制率檢測 觀察HUVE-12內皮細胞大體形態；測定內皮細胞抑制率；檢測NO、ET-1的含量，具體檢測方法參照試劑盒說明書。

2 結果

2.1 蒲黃黃酮對HUVE-12細胞形態的影響

正常組HUVE-12細胞飽滿，大小均勻，胞核較清晰，邊緣清晰，細胞透亮，呈鋪路石樣緊密排列（見圖1①）。缺氧組的HUVE-12細胞呈多角形，細胞輪廓明顯不清，細胞膜嚴重腫脹，細胞核界限不清，核周圍可見深色顆粒和空泡，視野內可見到多處細胞碎片（見圖1②）。蒲黃黃酮高、中劑量組和陽性對照干預組細胞輪廓與正常組比較形態欠清晰，細胞核界限欠清，但與單純缺氧組比較細胞腫脹程度輕（見圖1③～⑤）。蒲黃黃酮低劑量組細胞損傷程度較高、中劑量組嚴重（見圖1⑥）。

圖1 蒲黃黃酮對缺氧損傷后HUVE-12形態影響圖（×30）

2.2 蒲黃黃酮對缺氧損傷后HUVE-12的體外毒性影響

經MTT法檢測，當蒲黃黃酮濃度為150μg/mL時，與正常組相比，細胞抑制率為1.7%，表明對細胞無毒性作用，可用于后續試驗。

2.3 蒲黃黃酮對缺氧損傷HUVE-12細胞活性及NO、ET-1含量的影響

MTT法可反應細胞存活的數目，缺氧可引起內皮細胞減少，與正常組比較差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；蒲黃黃酮能抑制缺氧引起的細胞數目減少,低劑量組與缺氧組比較，P＜0.05；缺氧可使細胞培養上清液中NO含量降低，與正常組比較差異有顯著統計學意義（P<0.01），蒲黃黃酮可減少缺氧時內皮細胞NO的降低程度，低劑量組與缺氧組比較差異有統計學意義（P<0.05），且隨藥物濃度的增加抑制作用增強，高劑量組與缺氧組比較差異有顯著統計學意義（P<0.01），且蒲黃黃酮各濃度組與陽性對照組比較差異無統計學意義，說明缺氧時HUVE-12細胞NO的含量與蒲黃黃酮的濃度有一定的依賴性。缺氧時內皮細胞上清液中ET-1的含量升高，與正常組比較差異有統計學意義（P<0.01）,蒲黃黃酮可抑制缺氧時ET-1的分泌，低劑量組與缺氧組比較差異有統計學意義（P<0.05），高劑量組與缺氧組比較差異有顯著統計學意義（P<0.01），與陽性對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表1。

表1 蒲黃黃酮對缺氧損傷HUVE-12細胞抑制率、NO、ET-1含量的影響 （，n=5）

表1 蒲黃黃酮對缺氧損傷HUVE-12細胞抑制率、NO、ET-1含量的影響 （，n=5）

注：與正常組比較**P<0.01；與缺氧組比較△P<0.05，△△P<0.01。

組 別正常組缺氧組高劑量組中劑量組低劑量組陽性對照組（E2）藥物劑量（μg/mL）— —150 100 50 10-8mol/L抑制率(%)0 51.100**42.000△△37.700 43.300△36.600△△NO 的濃度（μmol/L）86.363±8.350 34.454±4.446**63.636±4.251△△54.090±7.774 39.090±8.860△62.272±5.230△△ET-1的含量（pg/mL）12.930±2.150 95.880±12.167**47.020±11.647△△61.080±13.275 74.640±15.620△49.700±9.577△△

3 討論

血管內皮細胞（VEC）是人體最大、最重要的一種內分泌器官，具有重要而廣泛的生物功能，在創傷修復、血管生成、動脈粥樣硬化等一系列生理病理過程中行使著重要的調節作用。研究表明，當嚴重感染、缺氧、中毒等時，VEC受損會引起內皮功能障礙[5]，本次實驗中，MTT法檢測結果顯示缺氧可明顯降低HUVE-12的細胞活性，蒲黃黃酮組和雌二醇組均能提高缺氧條件下血管內皮細胞的存活率，且隨著蒲黃黃酮濃度的變化，細胞存活率也會發生相應的改變。研究證實MTT比色法檢測蒲黃提取物(藥物濃度100～10 mg/L)對人臍靜脈內皮細胞具有明顯的促增殖作用[6]，與本研究結果相一致。

NO和ET是兩種主要的內皮源性血管活性因子，兩者與血管內皮細胞的功能也密切相關。NO可擴張血管，調節血壓，抑制血小板聚集，抗平滑肌細胞增殖，一氧化氮合酶是NO合成的唯一限速酶。ET-1是已知最強的縮血管和加壓物質，血管內皮細胞主要通過調控ET-1和NO的平衡來調節血管的功能。研究表明，缺氧時血管內皮細胞中ET-1mRNA分泌增多[7]。大量臨床研究亦證實缺血性心臟病患者血液中ET含量增加，造成細胞損害的原因是血漿ET升高可導致鈣通道或磷脂酰肌醇系統的激活，使Ca2+內流增加,引起細胞內Ca2+超載，故血漿ET的含量可在一定程度上反映血管內皮細胞受損程度。離體細胞實驗也表明，川芎內酯A能提高細胞培養液中NO、NOS的活性，減少細胞培養液中ET的活性，調節內皮細胞iNOSmRNA和ETmRNA的表達，減輕內皮細胞損傷，保護心肌的血管內皮細胞[8]。近期研究發現，17-β雌二醇的抗動脈粥樣硬化作用可能與其促進內皮細胞合成和釋放NO有關[9]。研究發現，17-β雌二醇可以保護缺氧對血管內皮細胞的損傷機制可能是通過減輕NO的下降程度，抑制ET-1的升高，或是直接抑制ET-1mRNA的表達，從而降低細胞的凋亡率實現的[10]。VEC中存在雌激素受體已得到證實[11]，在本次體外實驗中，陽性對照雌二醇組中的NO含量較缺氧組多,ET-1含量較缺氧組明顯降低，這與前面所提結論相一致。有學者在蒲黃對高脂黃酮血癥所致內皮損傷的保護作用的研究中發現，蒲黃有提高NO的作用[12]。蒲黃黃酮高、中、低各劑量組亦出現相同情況，在蒲黃黃酮3個劑量組之間，高、中劑量組相對于低劑量組減輕NO降低，抑制ET-1升高的作用要強。而蒲黃黃酮的類雌激素效應在課題組前期研究已經證實，提示：蒲黃黃酮對血管內皮細胞同樣具有保護作用，其作用可能是通過增加NO的濃度，經受體介導途徑上調一氧化氮合成酶（eNOS）的基因表達，增加eNOS的合成及其活性，抑制了ET-1mRNA的基因表達，調節NO/ET的平衡，還可能與蒲黃黃酮抗氧化活性以及抗自由基活性，抑制細胞內Ca2+的負荷，阻斷ET-1相關基因表達，最后發揮缺氧時對血管內皮細胞的保護作用，但其具體作用機制目前尚不十分清楚，有待進一步從分子、基因水平進行研究。

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（本文編輯 彭芝配）

Protective effect of Pollen Typhae flavone on anoxia-damaged vascular endothelial cells

LIN Jie,JIA Chun-yan,WANG Ruo-guang,WANG Xuan,XIAO Yan-juan Xiao,YE Zan
（First Affiliated Hospital,TCM University of Hunan，Changsha,Hunan 410007,China）

Objective To study the influences of anoxia on vascular endothelial cells(HUVE-12)activity,endothelin(ET)and nitrogen monoxidum(NO)contents.Methods The damage of vascular endothelial cells was induced by means of anoxia,the action of Pollen Typhae flavone on vascular endothelial cells was measured with MTT chromatometry,and the ET-1 and NO contents with enzyme-linked immunoassay.Results Pollen Typhaeflavone elevated cytoactive of anoxic HUVE-12,reduced NO lowering level（P<0.05） and inhibited ET-1 production（P<0.05）.Conclusion The protective effect of Pollen Typhae flavone exists a protective effect for anoxiadamaged vascular endothelial cells,which maybe related to the generation of NO and ET-1.

Pollen Typhae flavone;vascular endothelial cells;anoxic damage;protective effect

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.05.003.010.03

2011－02－27

湖南省自然科學基金資助項目（08JJ5030）。

林 潔（1964-），女，廣東蕉嶺人，主任醫師，教授，碩士研究生導師，國家第四批名老中醫學術繼承人，主要從事中醫、中西醫結合婦產科學臨床、科研及教學。