中醫不同治法對大鼠心肌缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響

譚元生，雍蘇南，唐 瑩，張 穩

（湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

中醫不同治法對大鼠心肌缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響

譚元生，雍蘇南，唐 瑩，張 穩

（湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

目的 觀察中醫不同治法補氣、活血、化痰對大鼠心肌缺血再灌注（I/R）誘導細胞凋亡及凋亡相關基因Bc1-2、Bax和氧自由基含量的影響。方法 建立大鼠動脈粥樣硬化在體心肌缺血再灌注模型，采用原位末端TUNEL法檢測心肌細胞凋亡指數（AI），鏈酶親和素-生物素-酶復合物(SABC)免疫組化法檢測凋亡相關基因Bcl-2、Bax蛋白表達，常規方法檢測丙二醇（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性。結果 與I／R組比較，中醫補氣、活血、化痰法均能降低AI，有效清除氧自由基，差異有統計學意義（P＜0.01）；與I／R組比較，其中活血法和化痰法均能上調Bc1-2表達、下調Bax表達，差異有統計學意義（P＜0.01），最終達到保護I／R心肌的目的。結論 中醫不同治法補氣、活血、化痰可能通過不同途徑預防I／R心肌細胞發生凋亡，從而對I／R心肌具有保護作用。

心肌缺血再灌注損傷；補氣法；活血法；化痰法；保元湯；血府逐瘀湯；瓜蔞薤白半夏湯；基因表達；氧自由基；大鼠

缺血性心臟病是嚴重危害人類健康的常見疾病之一，其基本的治療原則是恢復血流再灌注。但盡管血流恢復再灌注，心肌損傷反有加重，我們稱這種現象為心肌缺血再灌注損傷 (myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。 隨著治療缺血性心臟病的新技術、新療法在臨床的發展和應用，MIRI出現的幾率將更大，因而其防治尤顯重要。MIRI參與因素眾多，機制復雜，中醫學的整體觀辨證論治特色對此有其特有的優勢，中醫藥在防治MIRI及其并發癥方面具有很大潛力。本文在動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）大鼠心肌缺血再灌注損傷模型上，從分子水平探討補氣、活血、化痰不同中醫治法拮抗MIRI細胞凋亡機制的異同，對臨床治療缺血性心臟病提出新的觀點。現將實驗方法及結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性wistar大鼠50只，體質量（270±25）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。 許可證號：SCXK（滬 2007-0008）。

1.1.2 藥物 補氣法選擇保元湯（黃芪、人參、肉桂、甘草）；活血法選用血府逐瘀湯（桃仁、紅花、當歸、生地、川芎、赤芍、牛膝、桔梗、柴胡、枳殼、甘草）；化痰法選用瓜蔞薤白半夏湯（瓜蔞、薤白、半夏、白酒）。所有藥材均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房。

1.1.3 儀器 Micro-ESR型電子自旋共振波譜儀，美國產；TD5-Ⅱ臺式離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司生產；721分光光度計，上海第三儀器廠生產；SSW型電熱恒溫水槽，上海博迅實業有限公司提供；Thermo Shandon切片機，英國產；LKB-Ⅱ型超薄切片機，瑞典產；OPTON萬能光學顯微鏡，德國產；H-600透射電鏡，日本產。

1.1.4 試劑 原位細胞凋亡檢測試劑盒、Bcl-2、Bax免疫組化檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD),丙二醛（malondialdehyde,MDA)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備及分組 參照參考文獻[1]的方法，制備高脂乳劑，對50只wistar大鼠按10 mL/kg灌胃，每日1次，連續12周。隨機抽取2只大鼠，處死后速取主動脈，浸入4%多聚甲醛溶液中，固定48 h，石蠟包埋切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察發現已形成粥樣硬化斑塊，提示造模成功。隨機分成5組，即假手術組（sham 組）、IRI模型組(I／R 組)、補氣法組（BQ組）、活血法組（HX組）、化痰法組（HT組），每組10只動物。在大鼠AS模型的基礎上，手術建立大鼠MIRI模型：大鼠稱質量后氯胺酮80 mg/kg經腹腔注射麻醉。氣管切開接呼吸機人工呼吸，記錄Ⅱ導聯心電圖。開胸后以左冠狀靜脈主干為標志結扎左冠狀動脈。以心電圖ST段明顯抬高、結扎點遠端心肌發紺為結扎成功標志。結扎冠狀動脈左前降支30 min，復流3 h。sham組只穿線不結扎冠脈。

1.2.2 藥物的制備及給藥方法 保元湯、血府逐瘀湯、瓜蔞薤白半夏湯分別為水煎劑按照參考文獻[2]制備；給藥劑量均按60 kg成人與動物體表面積換算，保元湯以生藥0.95 g/kg，血府逐瘀湯以生藥1.37 g/kg，瓜蔞薤白半夏湯以生藥0.59 g/kg，給藥體積均按1 mL/100 g計算，于缺血再灌注前30 min給大鼠灌胃，缺血再灌注組給予等量生理鹽水。

1.2.3 心肌凋亡細胞原位檢測 采用末端脫氧核糖核酸轉移酶(TdT)介導的dUTP-生物素平移末端標記技術-TUNEL法(TdT-mediated dUTP end labeling)標記凋亡心肌細胞。具體操作步驟是切片常規脫蠟入水，新鮮配制3% H2O2，室溫處理10 min，蒸餾水洗滌2 min×3次；標本片加0.1 M TBS 1∶200新鮮稀釋 Proteinase K 37℃消化12 min，0.1 M TBS洗2 min×3次；標本片加標記緩沖液20 μL／片，以保持切片濕潤；按每張切片取TdT 和 DIG-dUTP 各1 μL， 加入 18 μL 標記緩沖液中，混勻；甩去多余液體后加標記液20 μL／片，置于濕盒中37℃標記2 h；0.1 M TBS洗2 min×3次，加封閉液5 μL／片，室溫3 μL后甩掉封閉液；用封閉液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體，5 μL／片加至標本片上，置于濕盒中37℃反應30 min，0.1 M TBS 洗 2 min×3 次；取 1 mL 0.1 M TBS加SABC 10 μL，混勻后加至切片，37℃反應60 min，0.1 M TBS洗 5 min×4次 。 DAB 顯 色30 min，水洗：蘇木素輕度復染，0.1 M TBS洗，蒸餾水洗，脫水，透明，封片，光學顯微鏡觀察結果。上述步驟中每組各選1張切片不加TdT酶(加等量蒸餾水)作為陰性對照。細胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡陽性細胞。每張切片隨機于×400物鏡下取5個視野，每組共40個視野，計數凋亡陽性細胞，以凋亡指數(Apoptosis Index，AI)反映各組心肌細胞凋亡的情況。AI=視野內凋亡細胞個數／視野內所有心肌細胞個數×100%。

1.2.4 Bcl-2、Bax基因蛋白表達的檢測 采用鏈酶親和素-生物素-酶復合物(strept avidin-biotin complex，SABC)免疫組化檢測凋亡相關基因Bcl-2、Bax蛋白表達。主要步驟：切片脫蠟入水→新配1%H2O2溶液封閉內源性POD 10 min→分別加入Bc1-2、Bax蛋白抗體，4℃過夜→PBS(pH 7.4)漂洗→加生物素化二抗37℃孵育2 h→加SABC 37℃孵育30 min→DAB顯色→蘇木素復染→光鏡觀察。上述步驟中不加一抗、二抗作為陰性對照。胞漿著棕黃色者為陽性表達細胞。在光鏡下200倍放大，通過圖像分析系統每張切片隨機選取10個視野，測定陽性染色的平均光密度與陽性細胞百分比，計算蛋白陽性表達指數 (positive expression index，PEI)：PEI=平均光密度×陽性細胞百分比×100，并求出Bax／Bcl-2的比值。

1.2.5 氧自由基的檢測 采用電子共振自旋波頻譜儀定量檢測心肌細胞氧自由基量。用黃嘌呤氧化酶法檢測血清SOD活性，用硫代巴比妥(TBA)法檢測MDA含量。

1.3 統計學分析

所有數據使用SPSS 14.0 for windows統計軟件進行數據分析，各組間比較采用方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著差值法（LSD），給藥前、后比較采用配對t檢驗。采用“”表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對各組大鼠心肌細胞凋亡指數的影響

光鏡下觀察，Sham組偶見凋亡陽性細胞，I／R組有大量的心肌細胞凋亡，且積聚成團，AI顯著高于sham組（P＜0.01）。BQ組、HX組及HT組心肌細胞凋亡數均較I／R組明顯減少（P＜0.01）。見表1。

2.2 對各組大鼠Bcl-2與Bax基因蛋白表達的影響

在sham組中，Bcl-2、Bax蛋白表達量都較少，Bax/Bcl-2比值接近 1；與 sham組比較，I／R組Bc1-2蛋白和Bax的表達量均有所上升(P<0.01)，但以Bax蛋白表達更明顯，Bax／Bc1-2顯著增高 (P<0.01)；與I／R組比較，BQ組 Bc1-2和 Bax的表達量無明顯上升 (P＞0.05)；HX組、HT組與 I／R組比較，Bc1-2蛋白的表達量顯著升高 (P<0.01)，Bax蛋白的表達量則明顯下降(P<0.01)，Bax／Bc1-2也顯著低于I／R 組(P<0.01)，見表 1。

表1 各組大鼠AI及凋亡相關蛋白的變化（n＝10，）

表1 各組大鼠AI及凋亡相關蛋白的變化（n＝10，）

注：與 sham 組比較 #P＜0.01；與 I／R 組比較△P＜0.01。

組 別sham組I／R 組BQ組HX組HT組藥物劑量(g/kg)— —0.95 1.37 0.59 AI(%)3.2±0.7 30.6±7.1#15.8±5.6#△16.4±6.2#△16.9±5.3#△Bc1-2蛋白0.24±0.03 7.42±2.13#7.44±2.08#16.87±4.92#△17.68±4.85#△Bax蛋白0.22±0.04 18.24±5.49#18.14±5.41#5.84±1.14#△5.43±1.21#△Bax/Bcl-2 0.89±0.33 3.23±0.10#3.26±0.11#0.34±0.58#△0.31±0.61#△

2.3 對各組大鼠心肌SOD、MDA含量的影響

sham組心肌組織的SOD具有較高的活性，MDA處于較低的水平。I／R組同sham組比較，則有明顯的氧化趨勢，SOD活性顯著降低 (P<0.01)，MDA含量顯著增高 (P<0.01)；3種中醫治法組同I/R組比較，MDA含量均明顯降低 (P<0.01)，SOD活性均顯著增高(P<0.01或 P<0.05)；其中補氣法和活血法在降低MDA含量、升高SOD活性方面優于化痰法，其差異有統計學意義（P＜0.05)。 見表 2。

表2 各組大鼠心肌 SOD、MDA 含量的變化（n＝10，）

表2 各組大鼠心肌 SOD、MDA 含量的變化（n＝10，）

注：與 sham 組比較 #P＜0.01；與 I／R 組比較△P＜0.01；與BQ 組比較※P＜0.05。

組 別sham組I／R 組BQ組HX組HT組藥物劑量(g/kg)— —0.95 1.37 0.59 SOD（mkat/g）2.75±0.30 1.35±0.16#2.21±0.25#△2.19±0.27#△1.80±0.24#※MDA（μmol/g）5.94±1.23 17.21±2.48#7.84±1.71#△7.91±1.82#△9.52±1.64#△※

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是急性心肌梗死早期再灌注治療過程中一個嚴重的并發癥。研究發現，再灌注損傷發病機制中一個重要的環節是心肌細胞凋亡。本實驗結果表明，心肌缺血再灌注后凋亡明顯增多，而使用3種不同中醫治法的方藥后凋亡細胞明顯減少，說明補氣、活血、化痰3種中醫治法均可預防心肌細胞凋亡。在心肌缺血／再灌注損傷中，凋亡的發生是受細胞周圍的刺激信號誘導或抑制，并由特定的基因控制。MIRI中產生的自由基，細胞內鈣超載等均是促進細胞凋亡的誘導因素。這些因素并不直接引起細胞凋亡，而是通過一定的信號傳遞方式激活生存或死亡相關基因，然后將信號傳遞到核內切酶，而執行死亡的功能。細胞凋亡由細胞內凋亡相關基因直接控制，Bax蛋白基因與Bc1-2蛋白基因具有高度的同源序列，Bax蛋白與Bc1-2蛋白可相互結合形成結合體，過度表達Bax蛋白可促進細胞凋亡并抑制Bcl-2蛋白的抗凋亡作用。因此，Bax蛋白和Bc1-2蛋白表達的比例決定細胞是生存還是凋亡。本實驗發現sham組中Bcl-2和Bax及凋亡細胞表達很少，而I/R組Bcl-2蛋白表達增加，有報道認為與心肌細胞受到缺血再灌注過程的刺激而反應性表達，以提高細胞的內在抵抗能力有關[3]；但Bax蛋白表達更多，Bax蛋白／Bcl-2蛋白比值增大，凋亡細胞增多，這進一步證明了Bax／Bcl-2比值與細胞凋亡的密切關系；給予3組不同治法的方藥治療后，HX組和HT組Bc1-2表達上調，Bax表達下調，Bax／Bcl-2比值下降，而BQ組的Bax和Bc1-2表達無明顯改善，提示活血法、化痰法可上調Bcl-2蛋白表達，下調Bax蛋白的表達，抑制心肌細胞的凋亡，以減輕心肌缺血再灌注損傷，而補氣法可能從其他分子途徑拮抗MIRI。

心肌細胞內氧自由基大量產生是再灌注心肌損傷發病的重要機制之一。超氧化物歧化酶(SOD)是體內存在的一種抗氧自由基酶,其活力的高低間接反應了機體清除氧自由基(OFR)的能力[4]，MDA為OFR發生脂質過氧化反應過程中形成的脂質過氧化物,其水平間接反應了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。兩者的變化可反映心肌的抗氧化能力[5]。本實驗顯示：與I／R組比較，3個中藥治療組大鼠在經歷I／R后，其SOD活性均明顯增高，MDA含量均明顯降低，提示中醫補氣、活血、化痰法均能夠有效清除氧自由基，提高機體抗氧化能力。但HT組在增高SOD活性及降低MDA含量方面均無BQ組、HX組明顯，說明中醫補氣、活血、化痰法均能通過促進清除大鼠心肌細胞I／R時所產生的氧自由基，減輕在體大鼠I／R心肌細胞凋亡，但化痰法清除氧自由基的作用效果不及補氣法和活血法。

本實驗表明，補氣、活血、化痰3種中醫治法均能有效預防MIRI后的細胞凋亡，其中活血、化痰法主要通過清除氧自由基，上調Bc1-2蛋白表達、下調Bax蛋白表達，最終達到保護I／R心肌的目的；補氣法則主要通過清除氧自由基來預防I／R心肌細胞發生凋亡，減輕I／R損傷。而關于補氣、活血、化痰這3種治療缺血性心臟病常用中醫治法對I／R心肌細胞凋亡影響的其他分子機制有待進一步探討。

[1]劉 明，董超仁，蘇靜怡.一種簡便實用的大鼠高脂模型[J].中國藥理學通報，1989，5（2）：119.

[2]李儀奎.中藥藥理實驗方法學[M].上海：上海科技出版社，1991：36.

[3]Palojoki E， Saraste A， Eriksson A， et a1.Cardiomyocyte apoptosis and ventricular remodeling after myocardial infarction in rats[J].Am，Physiol Heart Circ Physiol，2001，280(6)：H2726-H2731.

[4]Von Harsdoff R， Li P F，Dietz R.Signaling pathways in reactive oxy-gen species-induced cadiomyocyte apoptosis[J].Circulation，1999，99(22)：2 934-2 941.

[5]To ledo-Pereyra L H， Lop ez N F， To ledo A H.Reactive oxygen species and molecu lar b iology of ischemia/rep erfusion[J].Ann Tran sp lant，2004，9(1):81-83.

（本文編輯 彭芝配）

Effect of different treatments in TCM on myocyte apoptosis in myocardial ischemia reperfusion in rats

TAN Yuan-sheng， YONG Su-nan，TANG Ying，Zhang Wen
(First Affiliated Hospital,TCM University of Hunan,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To observe the effect of different treatments in TCM on myocyte apop tosis and expression of Bc1-2 and Bax and the content of oxygen free radicals in myocardial is chemiareperfusion in rats.Method The rats models in vivo of atherosclerosis myocardial is chemia reperfusion were stablished,the apoptosis index(AI)was detected withTUNEL method in situ end method,the apoptos is related genes Bcl-2Chain and Bax protein expression with avidin-bi otin-enzyme complex(SABC)immunohistochemical method,and the activity ofsuperox ide dismutase(SOD)and the content of malondialdehyde(MDA)with routine method.Results Compared with I/R group,all the treatments in TCM could reduce AI and remove effectively the oxygen free radicals（P＜0.01）,the activating blood and resolving phlegm methods could reduce the content of MDA and increase the activity of SOD and decrease Bax expression（P＜0.01）,and then,protect 1/R cardiac muscle.Conclusion The different treatments in TCM can restrain the apoptosis of I／R cardiac muscle cells and to protect consequently the I／R cardiac muscle.

book=146,ebook=146

apoptosis;benefiting Qi therapy;activating blood therapy;resolving phlegm therapy;Baoyuan decoction;Xuefu Zhuyu decoction;Gualou Xiebai Banxia decoction;gene expression;oxygen free radicals;rats

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2010.11.005.018.04

2010-11-08

湖南省教育廳科研項目（06C624）。

譚元生（1962-），男，湖南益陽人，醫學博士，主任醫師，教授，博士研究生導師，主要從事心血管疾病的中醫藥防治研究。