雄性“腎陽虛”亞健康大鼠模型的研究

李天禹 ，何清湖 ，盧芳國 ，劉朝圣 ，萬 勝

（1.遵義醫學院附屬醫院中醫科，貴州 遵義 410208；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學2008級博士研究生班，湖南 長沙 410208）

雄性“腎陽虛”亞健康大鼠模型的研究

李天禹1，何清湖2*，盧芳國2，劉朝圣2*，萬 勝3

（1.遵義醫學院附屬醫院中醫科，貴州 遵義 410208；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學2008級博士研究生班，湖南 長沙 410208）

目的 研究雄性“腎陽虛”亞健康大鼠模型，為調理男性腎陽虛亞健康找尋科學配方。方法 控制用藥劑量及灌胃時間，用維生素B4建立雄性“腎陽虛”亞健康大鼠模型，檢測腺垂體－睪丸軸激素、氧化損傷因子及抗氧化損傷因子、睪丸組織微細結構作為判斷亞健康組織學依據。結果 與正常大鼠相比較，模型大鼠血清FSH、LH、T均降低，均有統計學意義；模型大鼠血清SOD下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；MDA增加，差異有統計學意義（P＜0.01）；模型大鼠睪丸組織曲細精管規則，管腔變大，精子尾部有融合現象，生精細胞層次減少，排列較紊亂，出現空泡現象。結論 運用維生素B4建立的雄性“腎陽虛”亞健康大鼠模型成功。

腎陽虛；亞健康；維生素B4；大鼠

亞健康狀態是介于疾病與健康的身體低質狀態。男性因其生理特點決定其亞健康狀態在中醫分型中主要體現為腎陽虛證。目前就男性亞健康模型的建立還沒有報道，對男性亞健康的調理校正還沒有行之有效的辦法。探討調理男性亞健康方法，建立雄性“腎陽虛”大鼠亞健康模型勢在必行。根據亞健康的概念及亞健康的判斷標準[1-2]，特嘗試運用維生素B4建立雄性“腎陽虛”大鼠亞健康模型，現將實驗方法及結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用 20只清潔級 Sprague-Dawley雄性SD雄性大鼠，體質量20 g，4月齡，由湖南農業大學動物實驗室提供，合格證書：醫動字第04057號。適應性喂養1周后隨機分成兩組：正常組及“腎陽虛”亞健康模型組，每組10只。

1.1.2 藥物 維生素 B4（10 mg/片×100），浙江瑞新藥業股份有限公司（生產批號：20090317）。

1.1.3 試劑 卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、睪酮（T）－放免分析藥盒（北京科美東雅生物技術有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）－ELISA試劑盒（購于北京中山生物技術有限公司，美國R＆D公司產品）。

1.1.4 儀器 MK3酶標儀（芬蘭雷勃公司產品）；Olympus光學顯微鏡（臺灣）；RM2125石蠟切片機（德國 Leica公司產品）；AG204電子天平（瑞士梅托勒電子電器公司生產）；SORVALL Biofuge fresco 4℃離心機（德國）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及分組 維生素B4研末，用生理鹽水溶解，配制濃度為1%。“腎陽虛”亞健康模型組大鼠灌胃劑量為 0.1 g/（kg·d），連續 10 d。正常組大鼠按2 mL/只灌胃生理鹽水，連續10 d。

1.2.2 血清SOD活性、MDA含量的檢測 各組大鼠麻醉后經腹主動脈取血約2 mL離心 (2 000 r/min)10 min，吸取血清采用ELISA法檢測大鼠血清SOD、MDA的吸光值。運用ELISACalc工具將標準濃度及相關吸光值輸入計算，再輸入相關血清吸光值，計算出SOD活性、MDA含量。

1.2.3 血清FSH、LH、T濃度的檢測 各組大鼠麻醉后經腹主動脈取血約2 mL離心 (2 000 r/min)10 min，吸取血清送湖南中醫藥大學第一附屬醫院同位素科采用放免法檢測FSH、LH、T的濃度。

1.2.4 睪丸組織形態結構觀察 各組大鼠麻醉后剖腹，取一側睪丸，加入10%中性福爾馬林液固定；常規石蠟包埋。Leica石蠟切片機連續切片，片厚5 μm，取蠟帶貼于涂有蛋白甘油的載玻片上。常規蘇木精－伊紅染色，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固，光鏡下觀察。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 對各組大鼠血清SOD活性及MDA含量的影響

與正常組相比較，“腎陽虛”亞健康模型組大鼠活性降低(P＜0.05)，血清MDA含量增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)，表明“腎陽虛”亞健康模型組大鼠抗氧化損傷作用降低，氧化損傷因素增強。結果見表1。

表1 維生素B4對大鼠血清SOD活性及MDA 含量的影響 （）

表1 維生素B4對大鼠血清SOD活性及MDA 含量的影響 （）

注:與正常組比較 *P＜0.05，◆P＜0.01。

組 別 n SOD(U/L) MDA(nmol/L)正常組 10 7.91±0.124 1.70±0.12模型組 10 5.59±1.66* 2.76±0.38◆

2.2 對各組大鼠血清FSH、LH、T濃度的影響

與正常組相比較，“腎陽虛”亞健康模型組大鼠血清 FSH(P＜0.01)、LH(P＜0.05)、T(P＜0.05)濃度均降低，差異均具有統計學意義。提示“腎陽虛”亞健康模型組大鼠腺垂體－睪丸軸各內分泌激素均降低。結果見表2。

2.3 對各組大鼠睪丸組織形態學結構的變化

正常大鼠睪丸曲細精管形態規則，各級生精細胞、精子層次分明(A，B)。“腎陽虛”亞健康模型組大鼠睪丸細胞僅處于變性階段：曲細精管規則，管腔變大，出現精子尾部融合現象明顯，各級生精細胞層次減少，排列較紊亂，有空泡現象出現，但沒有出現細胞核濃縮、碎裂、溶解等壞死現象(C，D)。見圖1。

表2 維生素B4對大鼠血清FSH、LH、T濃度的影響（）

表2 維生素B4對大鼠血清FSH、LH、T濃度的影響（）

注:與正常組比較 *P＜0.01，◆P＜0.05。

組 別 n FSH(mIU/mL) LH(mIU/ML) T(ng/DL)正常組 10 4.56±0.52 4.51±1.71 0.26±0.05模型組 10 3.12±0.85* 2.52±1.02◆ 0.07±0.05◆

圖1 正常大鼠和“腎陽虛”亞健康模型大鼠睪丸組織比較（H.E.染色）

3 討論

亞健康的界定標準：①排除疾病源因素的疲勞和虛弱狀態；②介于健康與疾病之間的病前狀態(中間狀態)；③在生理、心理、社會適應能力和道德上的欠完美狀態；④與年齡不相稱的組織結構和器官生理功能的衰退狀態[2]。在亞健康狀態下，線粒體功能障礙，產生大量過氧化產物如MDA，大量消耗SOD等酶類[3]。亞健康的建模現在采用的是疲勞、睡眠剝奪、應激方法[4]，不能反映諸如形寒肢冷之類的“腎陽虛”亞健康表現。目前腎陽虛亞健康動物的造模方法，有干擾內分泌軸功能之嫌、無疾病狀態及亞健康狀態的明確界定[5]。選擇維生素B4建立雄性大鼠“腎陽虛”亞健康模型，控制用藥劑量及建模時間，既可確保腎陽虛證出現又可保證組織細胞變性而無結締組織變性及細胞壞死，即同時滿足了腎陽虛證的判斷標準和亞健康的界定標準[2-3]。腎陽虛證人群中，血清FSH、LH、T均較正常人群顯著降低[6]；腎陽虛模型小鼠血清SOD活性下降、MDA濃度升高[7]；維生素B4致腎陽虛大鼠睪丸組織萎縮、各級生精細胞變性、數量減少，精子產生明顯減少（P＜0.01）[3]。

運用維生素B4建立腎陽虛亞健康模型，其結果顯示：模型大鼠血清FSH、LH、T濃度均降低，出現腎陽虛證類似的內分泌激素改變結果；血清SOD水平下降及MDA濃度升高、睪丸組織細胞有變性改變，與腎陽虛證文獻報道結果相似。考慮是因為維生素B4直接降低17β－羥類固醇脫氫酶的活性，將雄烯二酮還原為T能力減弱，導致T合成減少[8]；通過腎素－血管緊張素－醛固酮系統影響睪丸、下丘腦、腺垂體等器官組織血液循環來損害相應器官[9]，或者下調下丘腦、腺垂體對相應促激素、促激素釋放激素；維生素B4代謝產物使組織中與糖、脂肪、蛋白質代謝有關的多種酶活性受抑制，影響了各組織的能量代謝所致[5]。根據組織損傷特點，引起細胞變性因素去除后，細胞形態和功能恢復正常，說明睪丸組織損傷處于可逆階段，提示維生素B4建立的“腎陽虛”雄性大鼠亞健康動物模型是成功的：達到腎陽虛證的內分泌激素紊亂、氧化損傷增強及抗氧化損傷因素減弱的標準[3]，睪丸組織病理損傷僅在變性程度。

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（本文編輯 彭芝配）

Study on sub-health model of male Kidney-yang deficiency in rats

LI Tian-yu,HE Qing-hu,LU Fang-guo,LIU Chao-seng,WAN Sheng
(Affiliated Hospital,Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563000,China)

Objective To explore the sub-health model of male Kidney-yang deficiency in rats and look for a method for regulation of male Kidney-yang deficiency in human.Method Vitamin B4was used to set up the sub-health rats model of male Kidney-yang deficiency,the level of anterior pituitary-testiculus axle hormone,the content of oxidative damage factors and anti-oxidative damage factors, the fine structure of testicle tissue were detected to measure histological baseness in sub-health condition.Result Compared with normal rats,the levels of FSH,LH,T and SOD were decreased(P＜0.05),and content of MDA was increased(P＜0.01).the seminiferous tubule structure of testicle tissue was neat but lumen was expanded.There were the part-fusing in sperm tail,spermatogenic cell-staging decreased,ranged abnormal and existed the vacuolus. Conclusion Vitamin B4can be used to establish the sub-health model.

Kidney-yang deficiency;sub-health;vitamin B4;rats

* 劉朝圣，男，湖南瀏陽人，副教授，博士，E-mail：chaoliu2807@sina.com。

R-332

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.01.006.022.03

2010－05－19

湖南省教育廳科學研究青年項目（08B057）；湖南省研究生科研創新基金項目（CX2009B173）。

李天禹（1966－），男，貴州遵義人，副教授，醫學博士，研究方向：中西醫結合男性病的研究。