大豆苷元對HEC-1B細胞增殖及雌激素受體報告基因表達的影響

劉小麗，薛曉鷗*，唐炳華，牛建昭

（1.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700；2.北京中醫藥大學基礎醫學院科研中心，北京 100029）

大豆苷元對HEC-1B細胞增殖及雌激素受體報告基因表達的影響

劉小麗1，薛曉鷗1*，唐炳華2，牛建昭2

（1.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700；2.北京中醫藥大學基礎醫學院科研中心，北京 100029）

目的 探討大豆苷元對子宮內膜癌細胞增殖的影響及其對雌激素受體報告基因表達的影響。方法 體外培養子宮內膜癌細胞子宮內膜癌雌、孕激素受體陰性細胞系（HEC-1B），采用四甲基偶氮唑鹽法（MTT）檢測不同濃度大豆苷元對子宮內膜癌細胞增殖的影響，同時檢測大豆苷元對雌激素應答原件（ERE）調控的雌激素受體α（ERα）和雌激素受體β（ERβ）的熒光素酶報告基因表達的影響。結果 大豆苷元對HEC-1B細胞體外增殖有明顯抑制作用,差異有統計學意義（P＜0.01），其抑制作用有明顯量效和時效性特征。在濃度為20～80×10-6mol/L的大豆苷元作用下，報告基因luc的表達較正常對照組明顯提高,差異有統計學意義（P＜0.05），在80×10-6mol/L時到達最高值；大豆苷元通過ERβ介導的報告基因表達水平的升高程度強于ERα，差異有統計學意義（P＜0.01）。結論 大豆苷元可通過調節子宮內膜癌細胞ERα和ERβ介導的報告基因的表達，調整ERα/ERβ比例，從而抑制子宮內膜癌細胞的增殖。

大豆苷元；子宮內膜癌；細胞增殖；雌激素受體；四甲基偶氮唑鹽法；報告基因

植物雌激素是一類結構和功能與雌激素相似的而源自植物的化合物，它具有與雌激素相似的酚環結構，能選擇性地與雌激素受體結合，而選擇性地發揮弱雌激素樣和抗雌激素樣活性。隨著植物雌激素的發現，人們開始著力研究對其子宮內膜癌的治療作用。大豆苷元是一種常見的植物雌激素之一，存在廣泛，但對于大豆苷元的抗腫瘤及受體調節作用尚缺乏深入研究。本文就大豆苷元對HEC-1B細胞的體外抗增殖作用及受體調節作用進行研究，旨在探討大豆苷元的抗腫瘤及其雙向受體調節作用活性。現將實驗方法及結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系與質粒 人子宮內膜癌細胞系HEC-1B細胞，購自協和醫科大學基礎醫學院細胞中心，傳代培養。β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）對照質粒pβ-gal-control購自CLONTECH 公司。重組報告基因載體pERE-TAL-luc是將5×ERE序列插入pTAL-luc質粒的多克隆位點（MCS）構建的重組報告基因載體質粒，由北京迪安生物科技有限公司構建合成。重組人ERα表達載體pCXN2-hERα和重組人ERβ表達載體pCXN2-hERβ由東京大學老年醫學系Satoshi Inoue博士惠贈，它們分別是將 hERα 的互補 DNA（complememtary DNA，cDNA）和 hERβ的 cDNA插入到pCXN2載體 MCS的EcoRI酶切位點構建而成的。

1.1.2 藥物 大豆苷元：北京中醫藥大學細胞與生化實驗室提供，純度99.8%，分子量為270.2。

1.1.3 試劑 NEAA培養液和無酚紅DMEM培養基、胰蛋白酶及乙二胺四乙酸(EDTA)購自北京邁辰公司生產；OPTI-MEM 1培養基購自Gibico公司；胎牛血清和無雌激素活性炭處理的胎牛血清購自Hyclone公司；二甲基亞砜(DMSO)、17β-雌二醇（17β-estrodiol，E2）購于 Sigma 公司；脂質體 lipofectamineTM 2000 Reagent購自Invitrogen公司；熒光素酶陽性對照 藥（Quantilum Recombinant Luciferase）、Steady-Glo熒光素酶檢測試劑盒（Steady-GloLuciferaseAssay System）、閃亮裂解緩沖液（Glo Lysis Buffer）、質粒提取試劑盒（plamid Minikit）、β-gal檢測試劑盒購自Promega公司；胰蛋白胨、酵母粉購自DIFCO公司；其它試劑均為國產分析純。

1.1.4 儀器 CO2培養箱 （MCO-18AIC， 日本SANYO公司）；倒置顯微鏡（日本尼康公司，型號：TS100）；生化培養箱（上海醫療器械公司，型號：HH-941）；水浴振蕩器（HZS-H型）；高速冷凍離心機（Sigma公司， 型號：3K15）； 多功能酶標儀（瑞士TECAN 集團公司，型號：SAFIRE2）；分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司，型號：AE163）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HEC-1B細胞培養在含有10%胎牛血清的NEAA培養液中，于37℃、5%CO2培養箱內培養至貼壁生長，根據細胞生長狀況2～3 d換液或傳代1次。

1.2.2 細胞接種 將處于對數生長期的HEC-1B細胞接種于24孔板，密度為2.0×105個/0.5 mL/孔，且培養液為無抗生素、含10%CDT-FBS的無酚紅NEAA培養液，分別設置正常對照孔、待測藥物孔，各組均設3個重復孔，實驗重復3次。

1.2.3 MTT實驗 選用對數生長期的HEC-1B細胞，用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA進行消化，用無抗生素、含10%CDT-FBS的無酚紅NEAA培養液配成細胞懸液，以104個/mL的濃度接種于96孔板內，每孔體積為100 μL（即每孔細胞數位1 000個），每組取6個復孔。待細胞貼壁后（24 h后），吸去孔內培養上清液，用1×PBS沖洗1次，加入不同濃度（20、40、80、160、320×10-6mol/L）的大豆苷元，每個濃度為 6個重復孔，同時用含10%CDT-FBS的無酚紅NEAA培養液做空白對照：將培養板放入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2及95%濕度條件下，連續培養24～96 h。每隔24 h，取其中1塊板加MTT 溶液20 μL，置37℃繼續培養4 h，終止培養后小心吸去孔內培養上清液，每孔加入200 μL DMSO，振蕩器振蕩10 min，使結晶充分溶解；選擇490nm波長在酶聯免疫檢測儀上測各孔的光吸收值，以空白孔調零，按下列公式計算細胞生長的抑制率。實驗重復3次。

抑制率%=（對照孔測定的平均OD值－加藥組測定的平均 OD值）/對照孔測定的平均 OD值×100%

1.2.4 報告基因法檢測大豆苷元對ERE調控的熒光素酶報告基因表達 于轉染前24 h將處于對數生長期的HEC-1B細胞接種于24孔板，密度為2.0×105個/（0.5 mL·孔），且培養液為無抗生素、含10%CDT-FBS的無酚紅NEAA培養液，分別設置正常對照孔和待測藥物孔，各組均設3個重復孔，實驗重復3次。于細胞接種24 h后進行質粒的轉染實驗。在不同的EP管中分別加入無血清、無抗生素的OPTI-MEM I 培養基各 50 μL， 分別加入 0.8μg pERE-TAL-luc、0.1μg β -gal-control、0.1μg pCXN2-hERα 或 0.1μg pCXN2-hERβ 質粒 DNA；在另一EP管中，用不含抗生素、不含血清的OPTIMEM I培養基稀釋脂質體，孵育5 min后將其加入質粒轉染混合物中，輕輕混勻，并使脂質體的終濃度為2.8 μL/100 μL培養液。常溫孵育20 min后，將DNA轉染混合物緩緩加入24孔板中的HEC-1B細胞培養液內，前后輕輕搖勻，置37℃培養箱中。6 h后，向各孔內加入不同受試物，分別包括：0.1%DMSO、一定濃度的大豆苷元，置于37℃常規培養24 h。于加藥后48 h取出培養板，小心吸出培養液，加入細胞裂解液150 μL，常溫裂解5 min。luc活性按照steady-Glo穩定熒光素酶檢測系統試劑盒（Steady-Glo luciferaze Assay System）說明進行檢測：于96孔板中加入不同樣品裂解液各100 μL，分別加入等量luc檢測底物，室溫避光5 min后，于多功能酶標儀上讀取熒光值。β-gal活性測定也依據試劑盒說明書進行：于96孔板中加入不同樣品裂解液各50 μL，加入等量檢測底物并于37℃孵育30～40 min后在酶標儀上讀取A420值，根據結果計算各樣品的標準化熒光素酶活性（熒光值/A420值）。

1.3 統計學分析

所有數據采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，以“”表示，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大豆苷元對HEC-1B細胞體外增殖作用的量效關系

采用不同濃度大豆苷元作用于HEC-1B細胞24 h后，結果顯示，大豆苷元對HEC-1B細胞體外增殖有明顯抑制作用，差異有統計學意義（P＜0.01），抑制作用隨藥物濃度增加更為明顯，在一定濃度范圍內呈濃度依賴性關系。見表1。

2.2 大豆苷元對HEC-1B細胞體外增殖作用的時效關系

大豆苷元對HEC-1B細胞的抑制作用的半抑制率（IC50）為 160×10-6mol/L 左右，因此選擇 160×10-6mol/L進行大豆苷元的時間依賴性研究。結果顯示，大豆苷元對HEC-1B細胞的體外增殖抑制作用隨作用時間增加而加強，差異有統計學意義（P＜0.05），72 h后抑制率達到最高值，此后抑制作用逐漸減弱。見表2。

表1 大豆苷元作用于HEC-1B細胞24 h量效關系（，n=6）

表1 大豆苷元作用于HEC-1B細胞24 h量效關系（，n=6）

注：與正常組比較▲P＜0.01。

濃度(10-6mol/L)正常組20 40 80 160 320吸光度值0.31±0.01 0.27±0.02▲0.24±0.03▲0.21±0.02▲0.19±0.04▲0.09±0.06▲抑制率(%)0 15.21 21.91 32.52 49.14 71.72

表2 大豆苷元作用于HEC-1B細胞時效關系（，n=6）

表2 大豆苷元作用于HEC-1B細胞時效關系（，n=6）

注：與 48 h 比較▲P＜0.01；與 72 h 比較△P＜0.05。

時間（h）24 48 72吸光度值（160×10-6mol/L）0.16±0.11▲△0.14±0.24△0.15±0.30抑制率(%)49.31 58.12 60.21

2.3 大豆苷元對ERE調控的熒光素酶報告基因表達的影響

大豆苷元誘導報告基因表達的結果均為luc熒光測定值與β-gal吸光度測定值的比值，即已去除了轉染效率上的差異對測定的影響。用pgal-control、pTAL-ERE-luc及 ERα 或 ERβ 共轉染HEC-1B細胞后經大豆苷元誘導48h，結果表明：大豆苷元濃度為20×10-6mol/L時已可顯著誘導ERα和ERβ報告基因的表達，luc活性值與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其誘導作用在80×10-6mol/L時到達最高值，其后逐漸下降；與10-8mol/L濃度的E2誘導組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），提示大豆苷元誘導ERα和 ERβ報告基因 luc表達的強度不及 E2。見表 3。

2.4 大豆苷元對ERE調控的ER-α、ER-β熒光素酶報告基因表達的影響

不同濃度大豆苷元對ERα、ERβ報告基因表達的影響，將相應濃度下分別測得的ERα或ERβluc活性值減去ERα和ERβ兩組正常對照組的共同平均luc活性值，得出ERα、ERβ熒光素酶報告基因各自變化值，再通過比較不同作用濃度下ERα、ERβ熒光素酶報告基因的變化值來觀察大豆苷元對ERE調控的ERα、ERβ熒光素酶報告基因表達的影響。從結果中可以看出，大豆苷元在40～80×10-6mol/L作用濃度下，ERβ的luc活性變化值明顯大于ERα的luc活性變化值，差異有統計學意義（P＜0.01），提示通過ERβ介導的報告基因表達水平的升高程度強于ERα。見表4。

表3 不同濃度大豆苷元對ERE調控的熒光素酶報告基因表達Luc活性的影響 （，熒光強度/A420）

表3 不同濃度大豆苷元對ERE調控的熒光素酶報告基因表達Luc活性的影響 （，熒光強度/A420）

注：與正常組比較▲P＜0.01，△P＜0.05；與雌二醇組比較 *P＜0.01，﹟P＜0.05。

組 別正常對照雌二醇大豆苷元大豆苷元大豆苷元大豆苷元濃度（mol/L）0 10-8 20×10-6 40×10-6 80×10-6 160×10-6 ER-α 305.09±44.61 11 784.08±12.71▲6 348.11±28.90▲*7 085.24±78.91▲*7 951.26±54.64△*1 116.34±16.35▲*ER-β 4 068.16±43.91 22 552.16±468.63▲11 860.12±405.04△*12 958.21±113.51▲*15 566.08±134.21▲#900.52±8.03▲*

表4 大豆苷元對ERE調控的ER-α、ER-β熒光素酶報告基因表達Luc活性變化值的影響 （，n=3）

表4 大豆苷元對ERE調控的ER-α、ER-β熒光素酶報告基因表達Luc活性變化值的影響 （，n=3）

注：與 ER-α 相比▲P＜0.01。

組別(10-6mol/L)正常組20 40 80 ER-α-508.21±44.63 2 787.23±28.91 3 523.31±78.91 4 420.21±54.61 ER-β 507.81±43.91▲8 299.21±404.04 9 397.20±114.34▲12 005.00±114.12▲

3 討論

近年來，植物雌激素在抗癌、防癌方面的功效備受關注。流行病學調查顯示[1-2]，攝取豆類食品相對多的地區乳腺癌等疾病的發病率明顯降低。我國一項對上海117名絕經期婦女的前瞻性對照研究表明，攝入豆類食品量及小便中異黃酮含量與乳腺癌的發病率呈負相關[3]。XU[4]等的基于人群學研究表明，經常攝入豆類食品可有效降低子宮內膜癌的發病。然而，關于以大豆苷元為代表的植物雌激素對于子宮內膜癌的防治作用的報導較少，其具體機制還有待進一步闡明。

子宮內膜癌是一種激素依賴性腫瘤，它的發生與雌激素的長期刺激和缺乏孕激素的有效拮抗有密切關系。雌激素的作用發揮與雌激素受體（ER）關系密切。雌激素是通過與其具有高度親和力的ER結合，從而引發相關基因的改變和基因編碼產物的生成，導致子宮內膜癌的發生，此即是經典的E-ER學說。ERα和ERβ在子宮內膜從良性病變到癌前病變再到癌的進展過程中都起了重要的作用，ERα、ERβ的平衡失調在子宮內膜癌的發生過程中起著更為重要的作用[5]。子宮內膜的增殖作用主要是通過ERα途徑介導而成[6]，ER β的確切作用不明,但體外研究表明在不飽和雌激素水平下，ERβ是 ERα作用的抑制劑，并且ERβ降低了所有細胞對雌激素的敏感性，是決定細胞對雌激素及雌激素拮抗劑作用的關鍵[7-8]。

大豆苷元是植物雌激素的主要成分之一，研究發現大豆苷元能抑制Ishikawa細胞體外增殖[9]，認為大豆苷元扮演著選擇性雌激素受體調節劑的角色[9]。本研究通過體外實驗發現，大豆苷元可明顯抑制子宮內膜癌HEC-1B細胞的體外增殖，其抑制作用隨藥物濃度的增加及作用時間的延長而明顯加強，在一定濃度和時間范圍內存在劑量和時間依賴性，由此可推斷大豆苷元具有一定的抗腫瘤活性，亦為臨床上運用植物雌激素防治子宮內膜癌提供了理論依據。

有研究表明，當體內雌激素水平低下時，大豆苷元發揮弱雌激素樣作用；同時它又能與雌激素競爭雌激素受體，因而具有抗雌激素作用。薛曉鷗等[10]研究結果表明,以金雀黃素為代表的大豆異黃酮類植物雌激素，對Ishikawa細胞ERαmRNA和ERβmRNA的表達的調節作用與其劑量有一定關系,即低劑量時能提高ERαmRNA和ERβmRNA的表達,高劑量時能抑制或不提高ERαmRNA和ERβmRNA的表達，推測大豆苷元有雌激素受體調節劑的作用。本實驗選擇雌、孕激素受體均為陰性的人子宮內膜癌細胞系HEC-1B細胞為研究對象，采用質粒轉染和報告基因檢測的方法，研究了不同濃度大豆苷元對HEC-1B細胞雌激素受體ERα和 ERβ的表達的影響。結果顯示：大豆苷元濃度為20×10-6mol/L時已可顯著誘導報告基因luc的表達，其誘導作用在80×10-6mol/L時達到最高值，其后逐漸下降，但其誘導報告基因luc的表達升高強度不及E2；此外，也可以看出，大豆苷元通過ERβ介導的報告基因表達水平的升高程度高于通過ERα介導的報告基因表達水平。基于此研究結果，我們推測：大豆苷元可通過調節子宮內膜癌細胞ERα和 ERβ的表達，調整ERα/ERβ比例，進而改變下游靶基因的表達，從而抑制子宮內膜癌細胞的增殖，這與臨床運用孕酮抑制子宮內膜癌細胞生長機制部分一致。

子宮內膜癌發病是多基因、多步驟的發展過程,其作用機制十分復雜。大豆苷元具有明顯抗腫瘤的作用,并且細胞毒性低于常規抗癌藥,因此，大豆苷元抗子宮內膜癌的治療有著廣闊的前景，其具體的臨床運用價值值得我們更深入的研究。

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［7］ Bardin A,Boulle N,Lazennec G,et al.Loss of ER expression as a common step in estrogen dependent tumor progression[J].Endocr Relat Cancer,2004,11(3):5 372-5 511.

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［9］高 敏，曹遠奎，薛曉鷗.大豆苷元對子宮內膜癌細胞增殖的影響及其機制的研究 [J].北京中醫藥大學學報（中醫科學版），2010，33（3）：162-165.

［10］薛曉鷗,魏麗惠.金雀黃素對子宮內膜癌細胞ER α和ER β mRNA水平的調節[J].北京大學學報，2005,37(3):278-279.

（本文編輯 彭芝配）

Effect of Daidzein on expression of fluorescein gene regulated by ERE in HEC-1B

LIU Xiao-li,XUE Xiao-ou,TANG Bing-hua,NIU Jian-zhao
(Dongzimen Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100700,China)

Objective To study the effect of daidzein on the proliferation of endometrial carcinoma in uterus and its mechanism.Methods Endometrial carcinomacell HEC-1B were cultured in vitro,the influences of genintein in different doses on the proliferation of HEC-1B cell were detected by MTT method,and the expression of luciferase reportor gene of ERα and ERβ effected by ERE were evaluated.Results Daidzein inhibited significantly the proliferation of HEC-1B cells in vitro(P＜0.01)and the effect was streghtened along with the increase of the dose and the prolong of action time. Under the control of daidzein concentration 20～80×10-6mol/L,the expression of reporter gene luc was increased compared with control group(P＜0.05)and reached the highest point in the concentration 80×10-6mol/L;the increase of reporter gene expression induced by ERβ was stronger than that induced luc expression either through ERα (P＜0.01).Conclusion Daidzein can inhabit the proliferation endometrial carcinoma through regulating the expression of ERα or ERβ,and regulating the balance of ERα/ERβ.

daidzein;endometrial caicinoma;proliferation;estrogen receptor;reporter gene

*薛曉鷗，女，教授，博士研究生導師，主任醫師，E-mail：xxo123@sina.com。

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2011.01.007.025.05

2010-10-26

國家科技部“十一五”支撐項目（2003BAI11B07-02）；首都醫學科技發展基金（F-2007-III-11）。

劉小麗（1976-），女，湖南邵陽人，醫學博士，主治醫師，研究方向為婦科腫瘤與內分泌。