滅幽湯對幽門螺桿菌感染性胃炎小鼠胃組織IKKβ表達(dá)的影響

施花錦 ，王小娟 ，伍參榮 ，郭建生 ，夏 歷 ，劉 羽

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

滅幽湯對幽門螺桿菌感染性胃炎小鼠胃組織IKKβ表達(dá)的影響

施花錦1，王小娟2*，伍參榮1，郭建生1，夏 歷2，劉 羽1

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

目的 探討IκB分子的上游蛋白激酶（IKKβ）在幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎（HAG）病理變化的可能作用機(jī)制及滅幽湯的影響效應(yīng)。方法 建立HAG模型，將造模成功的小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、麗珠得樂組，滅幽湯組。采用免疫組化法檢測胃黏膜組織中核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)、IKKβ的蛋白表達(dá)情況。HE染色觀察胃組織病理變化。結(jié)果 滅幽湯組能明顯減輕胃組織的炎癥反應(yīng)，滅幽湯組胃黏膜炎癥程度低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；能抑制HAG胃組織中NF-κB、IKKβ蛋白的活性，滅幽湯組NF-κB、IKKβ表達(dá)強(qiáng)度明顯低于模型對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 NF-κB和IKKβ在HAG的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，滅幽湯治療HAG的可能作用機(jī)制是通過抑制IKKβ的激活，阻止其活化。

滅幽湯；幽門螺桿菌；胃炎；核轉(zhuǎn)錄因子；IκB分子的上游蛋白激酶；小鼠；黃芩；蒲公英；烏賊骨

幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎（Helicobacter pyloriassociated gastritis，HAG）仍是目前消化系統(tǒng)的頑疾之一，H.pylori的致病機(jī)理尚不明確。因此，進(jìn)一步闡明HP相關(guān)性胃病的發(fā)病機(jī)制，開拓新的治療途徑是醫(yī)學(xué)界亟待解決的重要課題。近年來對NF-κB激活的信號(hào)通道研究較多，研究發(fā)現(xiàn)IKKβ是NF-κB信號(hào)途徑的關(guān)鍵成員，IKK的作用是結(jié)合并將IκB磷酸化，使NF-κB能入核。滅幽湯是臨床治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的有效復(fù)方，本研究從NF-κB、IKKβ的角度出發(fā)，探討滅幽湯對HAG的治療作用及可能的作用機(jī)制。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性昆明小鼠50只，體質(zhì)量（25±5）g，由湖南省長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(湘)2006-0001。

1.1.2 藥物 滅幽湯（由黃芩、蒲公英、青皮、陳皮、三七、白及，烏賊骨等藥組成）由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供，將中藥浸泡30 min后用武火煎煮3次，濃縮至含生藥2 g/mL，高溫滅菌后保存?zhèn)溆谩｛愔榈脴罚甥愔榧瘓F(tuán)麗珠藥廠生產(chǎn)（批號(hào)：國藥準(zhǔn)字，H10900086）。

1.1.3 試劑 快速尿激酶檢測試劑購自福建三強(qiáng)生物有限公司。免疫組化NF-κB、IKKβ和IL-8一抗、二抗及SABC,購自武漢博士德生物有限公司。

1.1.4 儀器 SHANDON-AS325切片機(jī)（上海科技大學(xué)儀器）；Y-I6生物組織攤烤片機(jī)（湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所）；Olympus雙目生物顯微鏡（日本Olympus公司產(chǎn)品）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模及分組 取昆明小鼠50只適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按體質(zhì)量均勻分組：正常對照組10只，造模組30只。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[1]，采用HP菌液灌胃法建立幽門螺桿菌感染動(dòng)物模型，除空白對照組外其他動(dòng)物實(shí)驗(yàn)組小鼠第1天經(jīng)禁食24 h后,用胃管灌胃50%乙醇0.2 mL/只，1 h后灌胃給以Hp菌株(109CFU/mL，0.5 mL)；實(shí)驗(yàn)在第 3、5、7、9 天重復(fù)上述操作。 于全部接種結(jié)束后第5天，分為滅幽湯組10只、麗珠得樂組10只，分別給予滅幽湯和麗珠得樂，用藥14 d，模型組、正常組分別給予等量的生理鹽水。

1.2.2 給藥方法及劑量 滅幽湯組按33.79 g/kg灌服滅幽湯煎液，麗珠得樂20 mg/kg，給藥劑量均按60 kg成人體表面積計(jì)算，相當(dāng)成人用量的4倍，空白組和模型組灌胃生理鹽水15 mL/kg每日1次，連續(xù)用藥2周。

1.2.3 胃黏膜病理組織學(xué)檢測 采用HE染色法觀察小鼠胃黏膜炎癥程度，炎癥程度分級(jí)參照人胃炎的分類法，均屬于慢性淺表性胃炎,根據(jù)炎細(xì)胞的數(shù)量及浸潤胃壁的深度分為3級(jí)并記分:無炎癥0分,輕度炎癥1分,中度炎癥2分,重度炎癥3分。

1.2.4 NF-κB、IKKβ的蛋白表達(dá) 采用免疫組化法檢測（操作方法參考相關(guān)試劑盒說明書）。采用病理圖像分析系統(tǒng)對免疫組化染色切片進(jìn)行圖像分析，每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野，在高倍鏡下計(jì)算其平均光密度（OD）求其平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 對各組小鼠一般情況觀察

模型組小鼠體毛缺乏光澤，精神不振，活動(dòng)遲緩，其余各組小鼠情況良好，各組小鼠體質(zhì)量和攝食情況無明顯變化。

2.2 對小鼠胃黏膜病理組織學(xué)的影響

光鏡下，正常組小鼠胃黏膜上皮完整，固有層內(nèi)有密集排列的腺體，大鼠胃黏膜底部可見極少量散在淋巴細(xì)胞。模型組大鼠胃竇部的炎癥程度較重，固有層內(nèi)可見較多的淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤。各治療組動(dòng)物的炎癥均較模型組有所減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表1可見給藥組的急性炎癥及慢性炎癥評分明顯下降。

表1 對各組小鼠胃竇部黏膜病理組織學(xué)的影響（n=10，）

表1 對各組小鼠胃竇部黏膜病理組織學(xué)的影響（n=10，）

注：與模型組比較*P<0.05；與麗珠得樂組比較★P>0.05。

組 別正常組模型組滅幽湯組麗珠得樂組劑量（g/kg）— —0.034 0.128胃黏膜慢性炎癥0.19±0.39*1.56±0.36 0.26±0.34*★0.48±0.34*胃黏膜急性炎癥0 1.38±0.42 0.20±0.40*★0.32±0.42*

2.3 對各組小鼠胃黏膜組織IKKβ和NF-κB表達(dá)的影響

正常對照組小鼠胃黏膜組織細(xì)胞內(nèi)均有少量IKKβ、NF-κB表達(dá)。與正常比較,模型組小鼠胃黏膜IKKβ及NF-κB表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；與模型組比較,滅幽湯組小鼠胃黏膜IKKβ及NF-κB表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與麗珠得樂組比較，滅幽湯組小鼠胃粘膜IKKβ及NF-κB表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.4 免疫組化NF-κB、IKKβ的蛋白表達(dá)

正常組胃黏膜組織細(xì)胞胞漿內(nèi)有少量NF-κB、IKKβ蛋白棕色顆粒狀陽性反應(yīng)物，模型組胃粘膜組織細(xì)胞胞漿內(nèi)有NF-κB、IKKβ蛋白棕色顆粒狀強(qiáng)陽性反應(yīng)物，滅幽湯組胃黏膜組織細(xì)胞胞漿NF-κB、IKKβ蛋白棕色顆粒狀陽性反應(yīng)物明顯減少，麗珠得樂組：胃黏膜組織細(xì)胞胞漿內(nèi)有中等量NF-κB、IKKβ蛋白棕色顆粒狀陽性反應(yīng)物，見圖1～2。

表2 各組小鼠胃黏膜組織IKKβ和NF-κB 蛋白表達(dá)情況 （n=10，，OD）

表2 各組小鼠胃黏膜組織IKKβ和NF-κB 蛋白表達(dá)情況 （n=10，，OD）

注：與模型組比較*P＜0.05；與麗珠得樂組比較★P＞0.05。

組 別 劑量（g/kg）NF-κBIKKβ正常組 — 0.125±0.086*0.068±0.042*模型組 —0.235±0.0880.251±0.078滅幽湯組0.1280.150±0.042*★0.126±0.120*★麗珠得樂組0.0340.137±0.076*0.104±0.074*

圖2 胃黏膜組織細(xì)胞中IKKβ的蛋白表達(dá)光鏡圖（免疫組化×200）

3 討論

NF-κB是細(xì)胞活化和產(chǎn)生細(xì)胞因子的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。在靜止細(xì)胞胞液中,NF-κB與IκB(κB的抑制劑)結(jié)合,處于失活狀態(tài)。細(xì)胞活化傳遞的信號(hào)激活 IκB 激酶(IKK),IKK 催化 IκBα(Ser32、Ser36)和IκBβ(Ser19、Ser32)磷酸化,使 IκB 與 NF-κB 解離后被降解,于是NF-κB進(jìn)入核內(nèi),調(diào)節(jié)多種基因轉(zhuǎn)錄[2]。當(dāng)受到某些細(xì)胞因子（如腫瘤壞死因子、白介素-1、白介素-8等）、脂多糖（LPS）、細(xì)菌及病毒產(chǎn)物及一些氧化劑等細(xì)胞外信號(hào)刺激時(shí)，刺激信號(hào)借受體將信號(hào)傳遞至胞漿，先激活I(lǐng)κB激酶（IKK）的上游激酶而促使IKK活化，活化的IKK可使IκBαN端調(diào)節(jié)區(qū)的兩個(gè)絲氨酸殘基scr32/36磷酸化，繼而泛素化，再經(jīng)26S蛋白酶小體降解，這時(shí)NF-κB二聚體從NF-κB/IκB α三聚體復(fù)合物釋放，發(fā)生核轉(zhuǎn)位從胞漿進(jìn)入細(xì)胞核，與其靶基因中啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的κB基因序列結(jié)合從而啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮其生物學(xué)作用。最新的研究發(fā)現(xiàn),IKK-β是I-κB磷酸化激酶,它誘導(dǎo) I-κB 磷酸化,使 NF-κB/I-κB 二聚體解離,暴露NF-κB的核定位片段是NF-κB活化和移位的前提[3-6]。本研究采用免疫組化法來反映機(jī)體受到外界刺激時(shí)導(dǎo)致NF-κB活化的上游激酶IKK-β的激活水平。

滅幽湯方中以清熱利濕、理氣和胃立法，結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗(yàn)組方而成。方以黃芩、蒲公英清熱燥濕解毒為君，以除脾胃之濕熱；青皮、陳皮行肝脾氣滯以疏通氣機(jī)；佐以三七、白及，既活血化瘀助青皮、陳皮協(xié)調(diào)氣血之運(yùn)行，又收斂生肌修復(fù)局部之病灶；重用烏賊骨制酸止痛而為之使。現(xiàn)代研究表明：清熱解毒中藥能夠改善胃黏膜炎癥細(xì)胞浸潤，黃芩、蒲公英能抗多種病原微生物，對多種球菌和桿菌有殺滅作用；白及祛腐生肌可修復(fù)糜爛的胃黏膜；烏賊骨含有豐富碳酸鹽和磷酸鹽能改變胃的酸性內(nèi)環(huán)境，抑制HP的生長；三七活血化瘀止痛、消炎生肌，能促進(jìn)血液循環(huán)消除組織水腫，促進(jìn)黏膜增生，加快修復(fù)，臨床研究顯示本方對HAG患者具有較好的療效。這些藥物直接或間接的抗炎作用可能是本方改善胃黏膜炎癥的基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，幽門螺桿菌感染性胃炎小鼠給予滅幽湯治療后，小鼠的胃黏膜組織黏膜炎癥部位NF-κB表達(dá)、炎癥細(xì)胞密度均顯著減低。IKK-β在模型組中的表達(dá)明顯高于正常組，說明其在HAG病理生理反應(yīng)和組織器官損害中發(fā)揮重要作用,經(jīng)滅幽湯干預(yù)后的IKK-β表達(dá)減少，滅幽湯可能通過抑制IKK-β的激活,阻斷NF-κB的活化，從而緩解了HAG的進(jìn)一步發(fā)生和發(fā)展，起到治療的作用。

[1]張榮光，段廣才.幽門螺桿菌感染的昆明小鼠模型的建立[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，86（12）：857-859.

[2]May M J.Science[M].1999,284:271-272.

[3]Kwok B H,Koh B,Ndubuisi M I,et al.The anti-inflammatory natural product parthenolide from the medicinal herb Feverfew directly binds to and inhibits IκB kinase[J].Chem Biol,2001,8(8):759-766.

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[5]Senftleben Uwe,Karin Michael.The IKK/NF-κB pathway[J].Crit Care Med,2002,30(1Suppl):S18-26.

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（本文編輯 彭芝配）

Effect of Mieyou decoction on expression of IKKβ in gastric tissue of Helicobacter pylori-associated gastritis in mice

SHI Hua-jin,WANG Xiao-juan,WU Can-rong,GUO Jian-sheng,XIA Li,LIU Yu
(TCM University of Hunan,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To discuss the effects of Mieyou decoction on IKKβ in Helicobacter pylori-associated gastritis(HAG)and its possible mechanisms on pathological changes.Methods After HAG models were established,the mice were randomly divided into model,Cabernet Franc Sidel and Mieyou decoction groups according to the weight.The expression of NF-κB and IKKβ protein in gastric mucosa tissue were detected with immunohistochemical and gastric tissue pathological changes with HE staining. Results The mucosal inflammation in Mieyou decoction group was significantly lighter than that in model control group(P<0.05);inhibit the activities of NF-κB and IKKβ,the expression intensity of NF-κB and IKKβ was lower than that in model group(P<0.05).Conclusion NF-κB and IKKβ play an important role in HAG inflammation,and the possible mechanism of Mieyou decoction is to inhibit activation of IKKβ to prevent activation of NF-κB.

Mieyou decoction;Helicobacter pylori;gastritis;IKKβ;NF-κB； mice；Scutellaria； Dandelion； cuttlefish bone

*王小娟，E-mail:shihuajin83@163.com。

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.01.009.033.03

2010－11－26

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（06JJ4038）；湖南省教育廳資助科研項(xiàng)目（07c496）。

施花錦（1983-），女，江西宜春人，碩士研究生，研究方向消化系統(tǒng)疾病。