滋陰活血解毒方對局灶性腦缺血模型大鼠血清中 IL-1β、IL-8、TNF-α 含量的影響

段春艷 ，陳 元 ，李定祥 ，鄧奕輝 *

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)2008級碩士研究生班，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410007）

滋陰活血解毒方對局灶性腦缺血模型大鼠血清中 IL-1β、IL-8、TNF-α 含量的影響

段春艷1，陳 元2，李定祥2，鄧奕輝2*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)2008級碩士研究生班，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410007）

目的 觀察滋陰活血解毒飲片及超微方對大鼠局灶性腦缺血后白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量的影響。方法 將25只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、滋陰活血解毒方飲片組（以下簡稱飲片組）、滋陰活血解毒方超微組（以下簡稱超微組）、阿加曲班組，每組5只。大腦中動脈線栓法復(fù)制局灶性腦缺血模型，進行神經(jīng)功能評分。造模成功后7 d，用TTC染色法測定腦梗死范圍，用Motic Med6.0數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)分析腦梗死面積。采用ELISA法測定大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α的含量。結(jié)果 飲片組、超微組及阿加曲班組大鼠腦梗死體積比均明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；模型組血清IL-1β、IL-8、TNF-α含量明顯高于假手術(shù)組（P<0.01），飲片組、超微組、阿加曲班組均能明顯降低大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α含量，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 滋陰活血解毒方能減小腦梗死面積，抑制炎性因子的表達，降低腦缺血所致的腦損傷。

滋陰活血解毒方；局灶性腦缺血；腦梗死體積比；IL-1β；IL-8；TNF-α；大鼠；熟地；枸杞；黃芪

缺血性腦血管疾病是目前危害人類健康的首要疾病之一，中醫(yī)藥對腦缺血的治療有著獨特的療效和優(yōu)勢。既往研究發(fā)現(xiàn)，滋陰活血解毒方對糖尿病后腦缺血具有腦保護作用。本次擬在以往研究基礎(chǔ)上，以 IL-1β、IL-8、TNF-α、腦梗死體積為觀察目標，研究滋陰活血解毒方對大腦中動脈閉塞腦缺血模型大鼠腦損傷的影響。現(xiàn)將實驗方法和結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量250～300 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。合格證號：HNASLKJ20100150。

1.1.2 藥物 滋陰活血解毒方（由熟地、枸杞子、黃芪、葛根、黃芩、野菊花、蒲公英、地龍、山楂、川芎、水蛭組成）飲片藥材從湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院購買，經(jīng)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定，超微中藥由春光藥業(yè)公司提供。中藥飲片水煎，煎煮2次，每次30 min，2次煎液混勻，超微開水沖溶，均濃縮成每1 mL含生藥量1.62 g。阿加曲班，天津藥物研究院藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：H20050918。

1.1.3 試劑 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)：國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：F20090922；IL-1β、IL-8、TNF-αELISA試劑盒由RD公司提供。

1.1.4 儀器 電熱恒溫水溫箱：型號，HH.W21.CU600，上海躍進醫(yī)療器械廠；酶標儀型號：Sunrisebasictecan，瑞士帝肯（TECAN）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥方法 大鼠25只，隨機分為模型組、假手術(shù)組、滋陰活血解毒方飲片組（簡稱飲片組）、滋陰活血解毒方超微組（簡稱超微組）、阿加曲班組,每組各5只。術(shù)前1 h開始灌胃給藥。每日灌胃、腹腔給藥總劑量均按60 kg成年人體表面積換算乘以2計算。滋陰活血解毒方飲片組和超微組

分別灌服滋陰活血解毒方飲片水煎劑、超微水溶劑，每日劑量為2 mL/100 g，阿加曲班組為腹腔注射給藥，第 1、2天每日劑量為 1.116 mg/100 g,第 3～7天每日劑量為0.372 mg/100 g。假手術(shù)組和腦缺血模型組均灌服等容量生理鹽水，每日劑量為2 mL/100 g。分2次給藥。造模成功后第7天取腦組織和血標本。

1.2.2 模型制備 采用大腦中動脈線栓法復(fù)制局灶性腦缺血大鼠模型。參照Zea Longa E等[1]線栓法。手術(shù)操作：10%的水合氯醛，按0.3 mL／100 g腹腔麻醉后，將動物固定于手術(shù)臺上，取頸正中偏左切口，逐層鈍性分離出左側(cè)頸總動脈（CCA）、頸內(nèi)動脈（ICA）、頸外動脈（ECA）和 ICA 旁邊一根小分支（翼突腭動脈），結(jié)扎頸總動脈、頸內(nèi)動脈，用動脈夾暫時夾閉翼突腭動脈。在頸總動脈近分叉處上處剪一“v”形切口，阻塞線由“v”形切口插入ICA，直到遇到輕微阻力為止，松開翼突腭動脈上的動脈夾。阻塞線從頸總動脈分叉處算起約長2.0 cm。固定阻塞線，依次關(guān)閉切口。假手術(shù)組只分離血管，不結(jié)扎CCA、ECA及ICA，不插入阻塞線。術(shù)中室溫保持在25℃，術(shù)后大鼠放于飼養(yǎng)盒中，自由飲水、進食并保溫。動物于清醒后2 h參照Zea Longa E[1]方法進行神經(jīng)功能評分，分值在1～3分者入組，余者舍棄，死亡不足動物隨機替補。

1.2.3 神經(jīng)功能評分 參考Zea Longa E方法5分制[1]神經(jīng)功能評分。0分：無明顯神經(jīng)病學(xué)癥狀；1分：不能完全伸展對側(cè)前肢；2分：向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走。

1.2.4 腦梗死體積測定 動物麻醉后，迅速斷頭取腦。大腦于-20℃冰箱冷凍15 min后。將大腦放于腦槽中，第一刀在腦前極與視交叉連線中點處，間隔2 mm連續(xù)冠狀位切片，切5片。將切片加入1%的TTC中，37℃恒溫孵育20 min，間斷翻動腦片，使均勻接觸到染色液。正常腦組織染為深紅色，腦梗死區(qū)不染色，呈灰白色，再置于4% 多聚甲醛溶液中固定6 h。用Motic Med6.0數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)攝像并計算面積。各腦片梗死體積（梗死面積乘以厚度）之和為梗死體積。

腦梗死體積比(%)=V梗死／V全腦×100%

1.2.5 血清IL-1β、IL-8、TNF-α 的測定 動物麻醉后，腹主動脈取血，離心后取血清。-20℃冰箱保存。檢測時按照 IL-1β、IL-8、TNF-α 試劑盒方法，經(jīng)ELISA法測定大鼠血清 IL-1β、IL-8、TNF-α 含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，進行方差分析，計量資料以“”表示。

2 結(jié)果

2.1 對大鼠神經(jīng)功能的影響

MCAO術(shù)后各模型組大鼠均出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙，模型制備成功。滋陰活血解毒方飲片方組、超微組及阿加曲班組，神經(jīng)功能障礙逐漸減輕，模型組神經(jīng)功能障礙無明顯改變。假手術(shù)組無神經(jīng)功能障礙現(xiàn)象。

2.2 對各組大鼠腦梗死體積比的影響

假手術(shù)組均未出現(xiàn)梗死灶；術(shù)后7 d模型組、飲片組、超微組、阿加曲班組均有梗死灶。梗死體積經(jīng)分析表明：滋陰活血解毒方飲片組、超微組及阿加曲班組腦梗死體積比均明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，而飲片組、超微組及阿加曲班組之間，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果見表1。

2.3 對各組大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α 的影響

腦缺血后，模型組和治療組血清IL-1β、IL-8、TNF-α均增加，和假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，滋陰活血解毒方飲片組、超微組及阿加曲班組IL-1β、IL-8、TNF-α含量均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與超微組比較，飲片組IL-1β、IL-8含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），TNF-α含量飲片組低于超微組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示滋陰活血解毒方和阿加曲班均能降低炎性因子的含量。結(jié)果見表1。

表1 對各組大鼠腦梗死體積比和血清 IL-1β、IL-8、TNF-α 的影響 （n=5，）

表1 對各組大鼠腦梗死體積比和血清 IL-1β、IL-8、TNF-α 的影響 （n=5，）

注：與假手術(shù)組比較▲P＜0.01；與模型組比較△P＜0.01；與超微組比較＃P＜0.05；●為第1～2天給藥劑量；●●為3～7 d給藥劑量。

組 別模型組假手術(shù)組飲片組超微組阿加曲班組藥物劑量（g/kg）— —34.2 34.2 11.16×10-3●3.72×10-3●●腦梗體積比（%）12.23±2.53 0 3.47±2.08△2.09±1.69△5.67±3.37△IL-1β（ng/L）56.77±0.76▲24.87±0.63 39.95±0.92△41.53±0.66△36.46±0.77△IL-8（ng/L）532.80±10.98▲350.20±4.66 402.80±11.34△382.20±11.77△393.40±10.01△TNF-α（ng/L）275.80±6.87▲165.20±2.59 172.20±7.94△＃185.80±8.58△176.80±4.02△

3 討論

腦缺血屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇。在中風(fēng)的發(fā)病機制與治療上，研究認為其病因為情志失調(diào)、飲食不節(jié)、精氣虧虛、勞倦過度等，是一個本虛標實之證，以肝腎陰虛為本，痰、瘀、風(fēng)、火為標。《醫(yī)林改錯》曰：“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣，必停留而瘀?！蹦I陰不足，化火生熱，煉液灼津則為痰，而痰、瘀等諸邪日久亦可化熱、化火。痰瘀火熱，蘊積不除，毒邪乃生，損傷腦髓。本方用熟地、黃芪、枸杞滋陰益氣，以補肝腎之陰。葛根輔以生津。黃芩、野菊花、蒲公英清熱解毒。川芎、水蛭、山楂活血行氣通絡(luò)。諸藥合用，共奏滋陰活血解毒之功，使祛瘀不傷正，扶正不留瘀。全方具有滋陰、益氣、活血、化瘀等功效。既往研究發(fā)現(xiàn)，滋陰活血解毒方對糖尿病后腦缺血具有腦保護作用。該方能顯著改善糖尿病合并腦梗死患者的臨床癥狀，改善神經(jīng)功能缺損程度,降低空腹及餐后血糖，降低糖化血清蛋白，降低甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、脂蛋白(a)[LP(a)]，并能有效地縮小顱內(nèi)血栓病灶[2]。在以人臍靜脈內(nèi)皮細胞株ECV-304為受試對象，以一定濃度的葡萄糖 (Glu)、胰島素 (Ins)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)體外血管內(nèi)皮細胞損傷時，滋陰活血解毒中藥對Glu、Ins、ox-LDL誘導(dǎo)損傷的血管內(nèi)皮細胞具有保護作用，而這一作用可能是通過促進內(nèi)皮細胞的纖溶功能、抑制與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細胞黏附過程等途徑實現(xiàn)的[3]。

滋陰活血解毒方能降低腦缺血模型大鼠血清中IL-1β、IL-8、TNF-α 的含量，減小腦梗死體積，降低腦缺血所致的腦損傷。腦缺血初期，在炎性細胞反應(yīng)之前即可出現(xiàn)炎性細胞因子的表達，如白介素、腫瘤壞死因子等，它們介導(dǎo)缺血損傷時的炎性反應(yīng)。IL-1是一種炎癥和免疫源性細胞因子,既能協(xié)同其他細胞因子促進B細胞與T細胞的活化，還能誘導(dǎo)其他炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，黏附分子的表達，白細胞浸潤的增加，誘導(dǎo)興奮性氨基酸和自由基產(chǎn)生,啟動多種細胞因子級聯(lián)反應(yīng)等[4]。IL-8在神經(jīng)組織早期炎癥反應(yīng)中，對中性粒細胞具有趨化活性和激活作用，引起中性粒細胞在缺血灶的聚集，造成組織損傷。IL-8還能生成氧化代謝產(chǎn)物，釋放細胞內(nèi)酶，促進神經(jīng)組織的炎性反應(yīng)。TNF-α是一種具有多效性作用的促炎細胞因子，在腦缺血后誘發(fā)的白細胞浸潤和組織損傷中起重要作用,能引起多核白細胞聚集和激活并釋放炎癥介質(zhì),因此如果通過各種措施阻斷TNF-α的表達，能減少缺血性神經(jīng)元損傷[5]。以上這些細胞因子與其他炎性代謝產(chǎn)物共同作用，從而加重腦損傷。

本次擬進一步研究滋陰活血解毒方對腦缺血模型大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α含量的影響。實驗結(jié)果表明：在腦缺血后模型組血清IL-1β、IL-8、TNF-α含量顯著升高。給予滋陰活血解毒方藥物干預(yù)后大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α含量明顯減少，腦梗死灶體積縮小。說明本方能有效抑制炎性因子IL-1β、IL-8、TNF-α 的表達，減少梗死面積，發(fā)揮腦保護作用。而超微顆粒作為一種新型中藥飲片，保持了傳統(tǒng)飲片固有的藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，從本實驗中考察發(fā)現(xiàn)中藥超微顆粒與普通飲片功效相同，可替代傳統(tǒng)水煎劑。

[1]Zea Longa E,Weinstein P R,Carison S,eta1.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomyin rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[2]鄧奕輝,崔連珠,喻 嶸,等.降糖通脈方治療糖尿病合并腦梗死32例臨床觀察[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，24(5):40-41.

[3]鄧奕輝,李定祥,喻 嶸,等.滋陰活血解毒中藥對血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2008,15(6):27-29.

[4]Castellanos M,Castillo J,Garcia M M,et al.Inflammation-mediate damage in progressing lacunar infarctions:a potential therapeutic target[J].Stroke,2002,（33）:982-991.

[5]Benveniste E N.Inflammatory cytokines within the central nervous system:sources,function and mechanism of action[J].Am J physiol,1992,（263）:1-9.

（本文編輯 彭芝配）

Effects of Ziyin Huoxue Jiedu decoction on contents of serum IL-1β,IL-8 and TNF-α in local cerebral infarction in rats

DUAN Chun-yan， CHEN Yuan， LI Ding-xiang， DENG Yi-hui
(TCM University of Hunan， Changsha， Hunan 410007， China)

Objective To observe the differenteffects of traditional Ziyin Huoxue Jiedu decoction and its ultra-micro pieces decoction on the serum contents of IL-1β,IL-8 and TNF-α in rats.Methods 25 rats were randomly divided into the sham-operated,model,traditional Ziyin Huoxue Jiedu decoction(TZHJD),ultra-micro pieces Ziyin Huoxue Jiedu decoction(UZHJD)and Argatroban Injection(AI)groups,5 rats per group.The models were reproduced by occluded middle cerebralartery.The neurologicalfunction were evaluated.Aftermodeling 7 days,the cerebral infarct range was determined by TTC,the cerebral infarct area was analyzied by Motic Med6.0 digital image analysis system,and the serum content of IL-1β,IL-8 and TNF-α were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)methods.Results Compared with model group,infarct volum ratio in all the TZHJC,UZHJD and AI groups were lower（P<0.01）,the content of IL-1β,L-8 and TNF-α in the model group was much higherthan that in the sham-operated group(P＜0.01),while the contents of IL-1β,IL-8 and TNF-α in all the TZHJC,UZHJD and AI groups were lower than that in the model group（P＜0.01）.Conclusion Zinyin Huoxue Jiedu decoction is effective to reduce cerebral infarct size,restrain inflammatory factor expression,and reduce the cerebral injury caused by cerebral ischemia.

Ziyin Huoxue Jiedu decoction;local cerebral ischemia;infarct volume ratio;IL-1β;IL-8;TNF-α;rats;prepared radix rehmanniae;wolfberry;Radix astragali

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.01.010.036.04

2010－10－28

湖南省科技廳資助項目（2009FJ3140）；湖南省教育廳青年基金項目（08B005）。

段春艷（1982-），女，湖南邵陽人，2008級碩士研究生，主要從事中醫(yī)藥防治腦血管病的研究。

*鄧奕輝，女，教授，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：dengyihui06@126.com。