環孢素A對異種脫細胞神經移植的影響

肖紅喜，胡 敏，李 妍，牛 宇

(1.解放軍第309醫院口腔科，北京 100091；2.解放軍總醫院口腔科，北京 100853；3.遼寧省遼河油田第二醫院口腔科，盤錦 124012)

面神經損傷是口腔頜面外科常見的疾病，臨床修復尤感棘手。近年來，脫細胞異種神經移植成為一種可供選擇的方法，其在動物實驗方面取得了顯著的效果。雖然周圍神經脫掉施萬細胞、外膜及束膜等成分之后，只剩有細胞外基質成分，其免疫原性在同種動物之間是微弱可以忽略的。但異種間周圍神經基質移植是否存在免疫排斥反應，以及免疫抑制劑對脫細胞異種面神經移植是否有效相關文獻報導很少。本實驗旨在探討異種脫細胞面神經移植過程中環孢素A的作用。

1 材料和方法

1.1 動物與分組

48只成年、健康的W istar雌性大鼠，體重180～210g［解放軍總醫院實驗動物中心(京)2007-0004］。隨機分為4組，每組12只。A組，異種面神經移植組；B組，異種面神經移植應用CSA免疫抑制劑組；C組，脫細胞異種面神經移植組；D組，脫細胞異種面神經移植應用CSA免疫抑制劑組。6只成年、雌性新西蘭大白兔作為供體，雙側面神經在無菌條件下取出，一部分無菌條件下保存，另一部分經深低溫冰箱保存的兔面神經條，生理鹽水室溫下復融，清除神經干表面疏松的纖維組織及脂肪組織，至較為堅硬光滑的神經外膜，生理鹽水反復沖洗神經3次。按下述步驟進行化學處理：(1)蒸溜水浸浴12h；(2)3%Triton X-100溶液浸浴12h；(3)蒸餾水浸浴3h；(4)4%脫氧膽酸鈉溶液中浸浴12h；(5)重復上述步驟；(6)蒸餾水浸浴3h；(7)取出萃取后的神經，外觀呈乳白色，略通透。放入無菌PBS溶液(pH 7.2)中，置于4℃冰箱中保存備用.

1.2 實驗方法

用1%戊巴比妥鈉麻醉后(60mg/kg)，在實驗鼠一側耳屏前及頜后做切口，翻瓣暴露面神經各分支。在頰支上用無菌剃須刀整齊切斷并切除神經干約1.0cm。然后選用相應粗細的兔異種面神經或兔脫細胞異種面神經1.0cm，于4倍手術放大鏡下用10-0尼龍線縫合神經外膜4～6針［3］。術后給予相應的藥物。CSA膠囊(瑞士諾華制藥有限公司，25mg/粒)，生理鹽水稀釋后制備成懸濁液，5mg/(kg·d)，應用灌胃針根據分組對動物進行灌胃治療，時間為5周。

1.3 電生理檢測

移植術后5周和12周，各組取6只大鼠，在麻醉狀態下循原切口切開皮膚顯露雙側面神經頰支和對應之口輪匝肌，刺激電極置于縫合口近心端在移植物的上端安放刺激電極，以方波刺激該神經，在該移植物的下端安放記錄電極以記錄該神經的動作電位，經肌電圖儀記錄儀描記后比較其神經傳導速度的變化。

1.4 染色方法

各組分別于術后5周與12周處死6只實驗動物，取移植段面神經，行組織學觀察。部分標本10%福爾馬林液中固定24h后，于移植段近心端0.2cm處、移植段中點及移植段遠端0.2cm處，行橫斷面與縱斷面5μm切片，HE染色和 Masson三色染色。另外部分標本3%戊二醛固定24h，樹脂包埋后行超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，在透射電鏡下觀察再生神經的超微結構。用HITACHI透射電鏡400倍下應用MPLAS 500彩色多媒體病理圖文分析系統，每片拍6張不同視野，計數橫斷面軸突數。

1.5 統計學方法

采用STATA7.0統計學軟件包進行統計學分析。處理所有計量資料，實驗數據以均數 ±標準差(±s)表示，組間差異顯著性檢驗采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 光鏡觀察

5周時，A、B組切片均頻繁出現神經結構的破壞。軸突水腫明顯，神經纖維粗細不均，呈脫髓鞘改變，有大量淋巴細胞浸潤，偶見再生神經纖維。神經纖維密度顯著降低。而C、D組可見大量再生神經纖維。12周時，A、B組仍呈現崩解片段，大量淋巴細胞浸潤，B組可見少量再生神經纖維(彩插1圖1，2)。C、D組有髓神經纖維排列整齊，軸突僅見輕微水腫，發育良好，密度同正常神經相似。可見大量新生血管，幾乎無瓦勒氏變性及炎性細胞浸潤(彩插1圖3，4)。

2.2 電鏡觀察

術后5周，各組神經再生單位形成均不明顯。術后12周，B、C、D組中基膜管中均可見明顯神經再生單位。C、D兩側神經纖維的直徑以及髓鞘厚度無明顯差異，髓鞘電子密度均勻，細胞內粗面內質網與游離核糖體均較豐富(彩插1圖5，6)。

2.3 軸突計數

5周和12周時，C，D組面神經頰支神經再生軸突數均高于A，B組(P＜0.05)，5周時，A，B組面神經頰支神經再生軸突數無顯著差異，而12周時，B組再生軸突數明顯高于A組(P＜0.05).

表1 面神經頰支軸突數目Tab.1 The number of nerve axonals

表2 面神經頰支傳導速度的比較(m/s，n=6)Tab.2 Comparision of conduction velocity between the bucal branches of facial nerve(m/s，n=6)

2.4 電生理測試結果

在移植段近側的正常神經上給予電刺激時，可以在口輪匝肌上記錄到誘發的運動神經傳導電位。復合動作電位測試表明，再生神經已經重建對頰支面肌運動的支配。不同時間段各組面神經頰支傳導速度的比較見下表(表2)，可見術后5周和12周，D組面神經頰支傳導速度均高于其它組(P＜0.05).

3 討論

施萬細胞是外周神經中最基本的免疫組成部分，周圍神經脫掉施萬細胞、外膜及束膜等成分之后，只剩有細胞外基質成分，其免疫原性在同種動物之間是微弱可以忽略的。組織工程化的脫細胞同種異體神經移植物，組織相容性好，排斥反應小，有較強引導神經再生的作用，已被較多的同種異體移植的研究所證明。化學去細胞異體神經移植修復周圍神經缺損已經用于臨床，且恢復效果較好，說明去細胞異體神經有著良好的應用前景［1］。為了便于臨床應用，克服人體周圍神經脫細胞移植物來源的困難，有人初步試驗了兔與大鼠的異種間移植，取得了與同種異體間移植類似的促進受損神經再生的效果［3］。目前還沒能異種脫細胞面神經移植的文獻報道。

CSA作為免疫抑制劑在器官移植領域已得到較為廣泛的應用，但長期應用 CSA會導致嚴重的并發癥［4］。在脫細胞異種或異體神經移植中，短期應用CSA，可以保證神經軸突順利通過橋接物，妨止橋接物在神經軸突接頭之前因排斥反應而吸收，從而導致神經移植失敗。劉世清認為CSA在異體神經移植中有效地起到了抗免疫排斥作用，其作用效果同療程在一定劑量范圍內呈正相關并存在一劑量臨界值，超過該值后神經再生的療效并不增加，并認為 5周是抗免疫排斥的最短有效時間［5］。Brenner等［6］研究了不同時間截點 CSA對神經移植的作用，認為40d和70d時，實驗結果無顯著差異。Kuo［7］等認為在小型豬面部部分組織移植中，CSA可以使免疫排斥反應延遲38到49 d。本實驗觀察了5周和12周時神經移植后的變化，發現應用免疫抑制劑組兩個時間點結果無顯著差異，說明當再生神經纖維軸突通過橋接物后，可以不再使用免疫抑制劑。應用免疫抑制劑組在兩個時間點的再生軸突數和面神經頰支傳導速度均高于其它組，說明免疫抑制劑在一定程度上克服了神經細胞外基質成分的排斥反應，但去除免疫抑制劑后神經活性功能需長期觀察。

［1］劉洪飛，胡敏，劉洪臣，等.同種異體神經行面神經缺損修復的初步應用［J］.口腔醫學研究，2007，23(6)：659-661

［2］王旭，陳學英，殷少芳，等.去細胞神經移植后再生神經纖維超微結構的觀察［J］.電子顯微學報，2009，28(3)：267-270

［3］張旭，才艷紅，賈樺，等.異種神經脫細胞移植物修復周圍神經缺損的實驗研究［J］.解剖科學進展，2007，13(1)：46-48

［4］Trififio S，Borensztajn J，Mehta J.Therapeutic cyclosporine (CSA) monitoring after allogenic hematopoietic stem cell transplantation(HSCT)：high-performance liquid chromatography (HPLC) or TDX［J］? Biology of Blood and Marrow Transplantation，2004：10(suppl 1)：103

［5］劉世清，李皓桓，彭昊，等.同種異體神經移植中環孢素 A的最短有效時間［J］.武漢大學學報，2002，23(2)：163-165

［6］Brenner MJ，Moradzadeh A，Myckatyn TM，et al.Role of timing in assessment of nerve regeneration［J］.Microsurgery，2008，28(4)：265-272

［7］Kuo YR，Shih HS，Lin CC，et al.Swine hemi-facial composite tissue allotransplantation：a model to study immune rejection［J］.J Surg Res.2009，153(2)：268-273.