肺腺癌VEGF－C的表達與MVD、MLVD及淋巴轉移的關系

董曉鵬 肖天輝 趙小剛 (山東大學第二醫院胸外科，山東 濟南 250033)

肺腺癌VEGF－C的表達與MVD、MLVD及淋巴轉移的關系

董曉鵬 肖天輝 趙小剛 (山東大學第二醫院胸外科，山東 濟南 250033)

目的 探討肺腺癌血管內皮生長因子－C(VEGF－C)表達與微淋巴管密度(MLVD)、微血管密度(MVD)及淋巴轉移之間的關系。方法 RT－PCR法檢測36例肺腺癌組織中VEGF－C mRNA的表達，并以免疫組化法檢測肺癌組織VEGF－C蛋白的表達、MLVD及MVD。結果 VEGF－C mRNA在肺腺癌組織中的表達比正常肺組織相對較高(P＜0.01)。VEGF－C蛋白表達在腫瘤周邊部位顯著高于腫瘤中心部位(P=0.015);其表達與腫瘤分化程度無關，與腫瘤的TNM分期有關，Ⅲ～Ⅳ期顯著高于Ⅰ～Ⅱ期(P=0.026)。在VEGF－C蛋白陽性組，MVD高于陰性組(P=0.020)，MLVD顯著高于陰性組(P=0.008)，淋巴結轉移增多(P=0.039)。結論 VEGF－C mRNA在肺腺癌組織中高表達，VEGF－C蛋白表達與肺腺癌血管生成及淋巴管生成和淋巴結轉移關系密切。

肺腫瘤;血管內皮生長因子;血管內皮生長因子受體－3;CD34

盡管化療、放療已經有了很大的進步，但肺癌長期生存率并未明顯提高，尤其是肺腺癌，早期即可發生血液和淋巴轉移，預后極差;因而研究肺腺癌的血管和淋巴管生成及轉移的相關機制，尋找阻斷其血液和淋巴轉移的新方法，具有非常重要的意義。血管內皮生長因子(VEGF－C)是VEGF家族的重要成員，是參與腫瘤血管生成和淋巴管生成的重要血管生成因子〔1，2〕，本文對肺腺癌組織中 VEGF－C、微淋巴管密度(MLVD)和微血管密度(MVD)進行了檢測，探討 VEGF－C與 MLVD、MVD及淋巴結轉移之間的相關關系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集山東大學第二醫院36例肺腺癌組織標本，其中男20例，女16例，年齡35～78〔平均(52.6±18.2)〕歲。高分化癌16例，中、低分化癌20例;TNM分期Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期22例。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和引物 采用RT－PCR法參照有關文獻設計相應引物，中科院上海生化所合成。引物序列:VEGF－C:5′－TGCCGATGCATGTCTAAACT－3′， 5′－TGAACAGGTCTCTTCATCCAGC－3′，249 bp;β－actin;5′－ATCATGTTTGAGACCTTCAACA－3′，5′－CATCTCTTGCTCGAAGTCCA－3′，317 bp。

1.2.2 cDNA制備 提取總RNA采用貝西生物技術有限公司RT－PCR試劑盒。取總 RNA 1 μg，加入 DEPC 處理 0.5 ml Eppendorf管中，組成 20 μl逆轉錄反應體系中，于 37℃，1 h，95℃10 min滅活鼠白血病病毒(MMLV)，終止逆轉錄。在上述20 μl RT產物的0.5 ml Eppendorf管中繼續加入試劑，組成PCR反應體系。快速離心混勻;95℃ 5 min，離心使蒸汽沉于管底，加入2 μl(1 U/μl)TaqDNA 聚合物。快速離心混勻;加入100 μl液體石蠟。循環條件:94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，循環 35次，最后一個循環72℃延長7 min。1.5%瓊脂糖電泳鑒定。用凝膠成像分析系統測出VEGF－C和β－actin mRNA的表達強度或計算相對系數。相對系數=特異性基因表達強度/β－actin表達強度。

1.2.3 免疫組織化學 將肺腫瘤標本用10%甲醛固定24 h后取材，脫水后石蠟包埋，所有蠟塊連續切片3張，每張厚5 μm，切片常規脫蠟，微波抗原修復。VEGF－C、VEGF 受體－3(VEGFR－3)多克隆抗體(北京中杉)按1∶200稀釋，按試劑盒(福州邁新公司)說明進行，最后DAB顯色，常規復染封片。用已知的陽性切片作陽性對照，PBS代替VEGF－C、VEGFR－3多克隆抗體作陰性對照。鼠抗人CD34單克隆抗體(北京中杉)工作液濃度1∶80，均為濃縮型產品。用已知的乳腺癌標本作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。VEGF－C免疫組化結果判斷:以細胞質呈現棕黃色顆粒為VEGF－C陽性細胞，每例切片至少計數10個400倍視野，計數陽性細胞占所有細胞的百分數，陽性細胞數＞25%為VEGF－C蛋白表達陽性。CD34陽性微血管結果判斷及計數方法:先在低倍鏡(100倍)下全面觀察切片，尋找血管高密度區，再在400倍視野下以與周圍腫瘤細胞和結締組織成分有明顯區別的、任何一個染成棕黃色的內皮細胞簇認為是一個微血管，只要結構不相連，其分支結構也作為一個血管進行計數，管腔＞8個紅細胞大小或帶有肌層的血管均不計數。記錄5個高倍視野內的微血管數，其平均值作為每例的MVD。VEGFR－3陽性微淋巴管結果判斷及計數方法:淋巴管主要分布在癌周組織，管腔較大，數量多，腫瘤內部未見成形的淋巴管樣結構。在低倍鏡(100倍)下尋找VEGFR－3陽性脈管密集區，換高倍鏡(400倍)選取5個視野計數，其平均值作為每例的MLVD。

1.3 統計學分析 以SPSS12.0統計軟件，計量資料采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗或精確概率法。

2 結果

2.1 VEGF－C mRNA在肺腺癌組織的表達 肺腺癌組織及其相應正常肺組織中VEGF－C mRNA都有不同程度的表達，在肺腺癌組織中高表達(0.644±0.109)，在正常肺組織中低表達(0.334±0.104)(P＜0.01)。見圖1。

2.2 VEGF－C表達與肺腺癌的臨床病理關系 VEGF－C陽性物質呈棕黃色細顆粒狀，主要位于癌細胞胞質，胞膜也有不同程度表達，有時亦見于癌組織間質脈管內皮細胞。VEGF－C表達有異質性，腫瘤邊緣的癌組織表達相對較強(26/36)，腫瘤內部相對較弱(12/36)(P=0.015)。VEGF－C表達與腫瘤分化程度無關，與腫瘤的TNM分期有關，14例Ⅰ～Ⅱ期標本中有7例表達陽性，而22例Ⅲ～Ⅳ期標本中有19例陽性，Ⅲ～Ⅳ期顯著高于Ⅰ～Ⅱ期(P=0.026)。見圖1。

2.3 VEGF－C蛋白與MVD、MLVD的關系 CD34陽性染色位于微血管內皮細胞，癌組織中微血管形態不規整，分布不均;癌灶邊緣血管最密集，成簇狀，部分呈發芽狀。VEGF－C陽性組MVD顯著高于陰性組(P=0.020)。見圖1，表1。

VEGFR－3主要表達在癌巢周圍間質脈管內皮細胞，腫瘤細胞偶見陽性反應，染色較弱。VEGFR－3陽性脈管呈管腔狀、條索狀，彌漫或散在分布在癌巢周圍間質，常可見癌細胞浸潤。微淋巴管主要分布在癌周組織，管腔大，數量多，腫瘤內部未見成形的淋巴管樣結構。VEGF－C陽性組MLVD顯著高于陰性組(P=0.008)。見圖1，表1。

2.4 VEGF－C蛋白與淋巴結轉移的關系 在VEGF－C陽性的26例病人中，21例淋巴結轉移，10例陰性病人中有4例淋巴結轉移(P=0.039)。見表1。

表1 肺腺癌組織中VEGF-C蛋白與MVD、MLVD及淋巴結轉移的關系

圖1VEGF-C mRNA、VEGF-C陽性、CD34陽性及VEGFR-3陽性表達

3 討論

VEGF－C 是 VEGF－C 家族的重要成員，VEGF－C 與 VEGFR－2結合參與血管生成的調控，與VEGFR－3結合則調控淋巴管生成〔1，2〕。溫劍虎等〔3〕發現肺癌腫瘤周邊與正常組織交界處的浸潤區域、增生活躍區域的間質中存在著顯著高于腫瘤中心的血管生成。CD34是一種高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，主要表達在血管內皮細胞，在眾多血管內皮細胞標記物中CD34更具敏感性和特異性，易于觀察，是作為計算MVD的依據。本文提示VEGF－C的表達與肺腺癌血管生成關系密切。

在許多人類腫瘤包括惡性黑色素瘤、肺癌和胃癌〔4〕等中均發現有VEGF－C的表達，并促進這些腫瘤的淋巴管生成和淋巴轉移，本研究發現VEGF－C mRNA在肺腺癌組織及其相應正常肺組織都有不同程度的表達，癌組織中VEGF－C呈高表達，而正常肺組織表達相對較低。動物實驗已證實腫瘤細胞可以通過表達淋巴管生成調控因子VEGF－C誘導淋巴管生成，促進腫瘤細胞淋巴道轉移〔5〕，本文以VEGFR－3陽性染色作為MLVD計數的依據，VEGFR－3作為淋巴管內皮標記物，已在研究中較多應用〔6〕，實驗發現，肺腺癌VEGF－C蛋白陽性組 MLVD比陰性組顯著增加，淋巴結轉移增多，說明VEGF－C的表達與肺腺癌淋巴管的生成和淋巴轉移關系密切。Onogawa等〔7〕在結腸癌中發現VEGF－C蛋白表達于腫瘤細胞浸潤邊緣，即腫瘤細胞與宿主細胞相連處表達最強，且VEGF－C表達與結腸癌浸潤深度、淋巴管侵犯、淋巴結轉移相關，陽性患者生存時間明顯短于陰性表達的患者。Hung等〔8〕發現易發生淋巴道轉移的甲狀腺乳頭狀癌VEGF－C蛋白表達顯著高于正常組織，在易發生血管轉移的髓樣癌表達顯著下降。VEGF－C表達促進腫瘤轉移機制可能是促進淋巴管內皮增生，淋巴管數目增多，增大了瘤細胞與淋巴管內皮接觸的表面積;增加脈管的通透性;改變淋巴管內皮黏附特性或表面趨化因子的表達〔9〕。VEGF－C的表達促進了新生淋巴管的生成，并進而促進了腫瘤淋巴轉移。

1 Yancopoulos GD，Davis S，Gale NW，et al.Vascular－specific growth factors and blood vessel formation〔J〕.Nature，2000;407(6801):242－8.

2 Makinen T，Veikkola T，Mustjoki S，et al.Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth，survival and migratory signals via the VEGF－C/D receptor VEGFR－3〔J〕.EMBO J，2001;20(17):4762－73.

3 溫劍虎，朱 冰.抗CD34單抗標記血管生成在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義〔J〕. 免疫學雜志，2000;16(4):289－91.

4 Ishikawa M，Kitayama J，Kazama S，et al.Expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)－C in preoperative biopsy specimens and metastatic foci of regional lymph nodes in submucosal gastric carcinoma〔J〕.World J Surg Oncol，2005;3(1):2.

5 Makinen T，Jussila L，Veikkola T，et al.Inhibition of lymphangiogenesis with resulting lymphedema in transgenic mice expressing soluble VEGF receptor－3〔J〕.Nat Med，2001;7(2):199－205.

6 呂志強，李海剛，謝德榮，等.非小細胞肺癌組織中VEGF－C和VEGFR－3 的表達及其臨床意義〔J〕. 癌癥，2005;24(9):1132－5.

7 Onogawa S，Kitadai Y，Tanaka S，et al.Expression of VEGF－C and VEGFD at the invasive edge correlates with lymph node metastasis and prognosis of patients with colorectal carcinoma〔J〕.Cancer Sci，2004;95(1):32－9.

8 Hung CJ，Ginzinger DG，Zarneger R，et al.Expression of vascular endothelial growth factor－C in benign and malignant thyroid tumors〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2003;88(8):3694－9.

9 Nathanson SD.Insights into the mechanisms of lymph node metastasis〔J〕.Cancer，2003;98(2):413－23.

Impact of VEGF-C expression on MVD，MLVD and lymph-node metastasis of lung adenocarcinoma

DONG Xiao-Peng，XIAO Tian-Hui，ZHAO Xiao-Gang.
Department of Thoracic Surgery，Second Hospital of Shandong University，Jinan 250033，Shandong，China

ObjectiveTo investigate the relationship of vascular endothelial growth factor－C(VEGF－C)，microlymphatic vessel density(MLV)，microvessel density(MVD)and lymph node metastasis in lung adenocarcinoma.Methods The expression of VEGF－C mRNA was detected by semi－quantitive reverse transcriptase－ polymerase chain reaction method and the expression of VEGF－C，MLVD and MVD was assayed by immunohistochemistry in 36 cases with lung adenocarcinoma.Results Expression of VEGF－C mRNA was higher in lung cancer than that in normal lung tissue.Among 36 cases of lung adenocarcinoma，the positive rate of VEGF－C mRNA was 72.2%(26/36).The expression of VEGF－C in cancerous invasive edge was significantly higher than that in the center of cancerous tissues(P=0.015). Ⅲ ～Ⅳstages of lung adenocarcinoma showed strong expressions of VEGF－C thanⅠ ～Ⅱ stages(P=0.026).The MVD，MLVD and positive lymph node in positive VEGF－C group were higher than those in the negative group.Conclusions Expression of VEGF－C mRNA is high，and the expression of VEGF－C is related with the angiogenesis，lymphangiogenesis and lymph node metastasis in lung adenocarcinoma.

Lung neoplasms;Vascular endothelial growth factor;Vascular endothelial growth factor receptor－3;CD34

R734.1

A

1005-9202(2011)12-2177-03

山東省自然科學基金青年基金(Q2007C12)

董曉鵬(1979－)，男，碩士，主治醫師，主要從事肺癌的基礎與臨床研究。

〔2010－05－26 收稿 2011－02－28 修回〕

(編輯 袁左鳴/曹夢園)