擬南芥溫敏雄性不育突變體atms1的獲得及表型分析

戴文懿， 孫亞梅， 高 貝， 周樹敏， 袁曉君， 韋嘉勵， 張 衛

(上海大學生命科學學院，上海200444)

植物由于無法自由移動，因此必須在進化過程中發展一系列能力來適應多變的環境因素以繁衍后代.對植物生長繁殖影響重大的環境因素主要有溫度、光周期、光強、光質、濕度、土壤中的水分和養分等［1-4］.目前，在環境因素對植物生長發育控制或影響的基礎研究領域，進展最快的是利用模式植物水稻和擬南芥進行的研究，其中水稻作為最重要的農作物之一，已在水分或養分的缺乏、鹽脅迫等對植物生長的影響，以及光照對植物開花控制等方面獲得了重要的研究進展.溫度是影響植物生長繁殖最重要的環境因素，早先人們對溫度影響植物生長發育的研究集中在植物如何抵御極端溫度(低至冰點溫度以下，高至40℃以上)的傷害方面，并且對于起源于寒溫帶植物的春化現象也有了突破性的進展［5］.近幾年，對于非極端溫度以外的常溫(或者非脅迫溫度)對植物各個生長發育時期影響的研究也取得了一定的進展.Weigel實驗室率先對常溫下若干擬南芥開花突變體的表型進行了觀察，并探討了一些控制開花的關鍵基因在不同溫度下的轉錄表達.他們發現，像FT等控制開花的關鍵基因在低溫16℃和常溫23℃下的轉錄表達水平顯著不同;自主途徑控制開花基因，如FCA等，在介導溫度變化對擬南芥開花的影響方面起著主導作用［6-10］.Kumar等［11］發現某種類型的核小體組蛋白可以感知外界溫度的變化，并在轉錄水平調控植物適應外界溫度條件的變化.這些研究進展，預示著常溫控制植物生長發育的研究可能在近期會有重大突破.

在農業生產中，對非脅迫范圍內的溫度，即常溫變化敏感的雄性不育作物已經被廣泛用于雜交作物的生產中［12］.以雜交水稻為例，目前在我國的超級雜交稻生產中，育性轉換臨界溫度低的溫敏雄性不育系已經作為主要的雄性不育系被廣泛用于雜交稻的制種.這類溫敏雄性不育系在較低溫下可育，而在常溫(即指適合水稻生長發育的溫度范圍)和高溫下不育，因而在常溫下被用于雜交制種，而在低溫下用于育性恢復、自交繁殖不育系的種子.在作物雜交優勢利用中，溫敏雄性不育系具有無需保持系、幾乎可以任意選擇恢復系、制種術簡便、較易選配出優良的雜交組合等優點.但是，這類溫敏核不育水稻存在育性漂移的問題［5，12］，并且在目前所有的雜交作物中，尚未有溫敏雄性不育基因克隆鑒定的報道，也不清楚育性調控的分子基礎，這些都極大制約了對溫敏雄性不育系的開發利用.

擬南芥作為模式植物的優良特性已為廣大植物遺傳學的研究者所共識.從目前雄性不育領域的研究發展來看，水稻和擬南芥在該領域具有非常相近的遺傳學途徑和基因組分，因此，利用擬南芥開展溫敏雄性不育的研究可能是非常好的突破口.本實驗室篩選到了1株經甲基磺酸乙酯(EMS)化學誘變的擬南芥溫敏雄性不育突變體atms1，并就不同溫度對其育性和花粉花藥形態學等方面的影響進行了研究.

1 材料和方法

1.1 材料來源

野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana)為生態型Columbia(Col-0)，擬南芥atms1為本實驗室用EMS誘變得到的溫度敏感雄性不育株系.

1.2 實驗方法

1.2.1 植物種植

擬南芥種子播種在V(黑土)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=1∶6∶0.25的混合土中，4℃春化2～4 d后，以塑料薄膜覆蓋;然后，在20℃，濕度為60%～70%，光照強度為50 μEm-2·s-1，16 h光照/8 h黑暗的條件下培養，種子萌發后揭去薄膜;待植物抽薹后移至人工氣候培養箱中，分別以16，23和27℃3種溫度培養10 d.

1.2.2 花藥育性觀察

待擬南芥抽薹后分別放到16，23和27℃的人工氣候培養箱中培養，培養10 d后每隔3 d取一次花，約3～6朵，共取3次.用亞歷山大染色方法染色固定，觀察花粉育性.

1.2.3 石蠟切片

取花序中不同發育時期的花苞，用FAA固定液固定，經乙醇系列脫水和二甲苯透明后，浸蠟并包埋，用旋轉式切片機做連續橫切片，切片厚度為4～6 μm，硼酸-甲苯胺藍染色，中性樹膠封片.在LEICA DM2500光學顯微鏡下觀察并拍照.

1.2.4 植物果莢觀察方法

按V(冰乙酸)∶V(酒精)∶V(丙三醇)=1∶1∶1的比例混合配置透明液，將果莢放入透明液中煮沸，約10 min后將果莢取出觀察.

1.2.5 突變體的背景純化與遺傳分析

以擬南芥野生型Col-0為父本，突變體為母本進行回交得到F1代，F1代自交后得到F2代.種植并觀察F2代表型，統計F2代中可育植株與不育植株的比例.

2 實驗結果與分析

2.1 atms1的可見表型觀察和育性分析

atms1是經化學誘變劑EMS誘導擬南芥野生型Col-0種子，并從建立的突變體庫中篩選得到的雄性不育植株，它與野生型擬南芥(以下簡稱野生型)的形態學比較如圖1所示，育性分析比較如圖2所示.當環境溫度為23℃時，野生型植株正常生長，生長40 d抽薹后的atms1與野生型相比在整株形態上沒有顯著差異(見圖1(a)).從果莢來看，野生型的果莢大，種子發育全部正常(見圖1(d))，而atms1的果莢小于野生型，且種子發育出現空癟現象，如圖1(f)的箭頭所示.雄蕊中部分花絲比野生型短小，花器官解剖結果如圖1(h)和圖1(i)所示.亞歷山大染色及育性統計結果顯示：野生型花粉粒的不育率接近0，而atms1花粉粒的不育率約為40%(見圖2(b)、圖2(d)和圖2(e)).當野生型的花粉和atms1的雌蕊雜交后，atms1產生了肥大的果莢，形態大小和23℃環境中生長的野生型植株產生的果莢無明顯差別，內有30～40粒種子.這些結果說明該atms1是雄性不育，并且只是部分雄性不育.

在27℃培養10 d后，野生型仍能產生正常果莢，但atms1產生的果莢短小且內無正常種子(見圖1(g)).通過對花藥的進一步觀察，發現atms1的花藥與野生型相比，顏色呈黃褐色且表面光滑無花粉粒(見圖1(b)和圖1(c))，而且atms1的雄蕊花絲較短，使得雄蕊的花藥無法與雌蕊的柱頭觸碰(見圖1(j)).亞歷山大染色育性統計結果顯示：野生型花粉粒的育性基本正常，atms1花粉粒的不育率達到80%左右(見圖2(c)和圖2(f)).此外，當把atms1從23或27℃移到16℃的環境條件下培養1周后，植株又能結出正常果莢(見圖1(e))，且花粉粒染色及育性統計結果與野生型相同(見圖2).

圖1 野生型與atms1的植株、花藥、果莢和花的形態學比較Fig.1 atms1 plant，anther，silique and flower compared with wild type

圖2 野生型和atms1在不同溫度下的花粉育性統計和花藥圖Fig.2 atms1 pollen fertility statistics and anther compared with wild type

2.2 不同溫度下atms1花藥的發育

花藥發育是一個非常精細復雜的過程，受到多種基因的調控.Paul等［13］將花藥發育分為14個時期.花藥在不同發育時期具有特定的組織結構特征以及細胞學特征.通過對不同環境溫度條件下atms1花藥發育的研究顯示：當環境溫度為16℃時，atms1花藥發育的14個時期與野生型表型相同，花藥發育完全正常;在環境溫度為23和27℃條件下處理10 d后，在花粉母細胞進行減數分裂前，atms1與野生型花藥的發育未出現差異，而當花粉母細胞減數分裂后，atms1的花藥發育出現明顯的差異.23℃處理10 d后，atms1花粉母細胞減數分裂后的表型與野生型花藥相似(見圖3(a)～圖3(j)).27℃處理10 d后，atms1花藥中花粉母細胞胼胝體和野生型相比明顯單薄(見圖3(k)).雖然atms1的花粉母細胞也能分裂產生四分體(見圖3(l))，但是到了單核花粉粒階段，atms1花藥的絨氈層明顯比野生型肥厚，且在絨氈層細胞中出現大液泡，如圖3(m)箭頭所示.在雙核花粉粒階段，atms1的絨氈層仍處于肥厚且含大液泡的狀態(見圖3(n))，而野生型的絨氈層此時已退化，并形成致密的一圈(見圖3(d)).同時在此發育階段，atms1中同一朵花的各個花藥所處的發育時期也出現顯著差異，甚至同一個花藥的4個花藥室的發育都不同步.正常條件下，當花藥發育到成熟花粉期，野生型的花藥壁開裂，大量花粉粒被釋放(見圖3(e)).但在23℃處理10 d后，atms1產生的花粉粒較少，且有少量的花粉粒敗育，如圖3(j)箭頭所示;而27℃處理10 d后，atms1的絨氈層在該時期尚未完全降解，花藥中還殘存少量絨氈層細胞，如圖3(o)箭頭所示.由于atms1花藥絨氈層的發育明顯滯后于同時期的野生型花藥，導致其不能產生正常的花粉粒，從而影響到授粉、受精等后續事件的正常進行，進而影響了植株的育性.

圖3 野生型和atms1的花藥發育Fig.3 Development of anthers in atms1 compared with wild type

隨著溫度的升高，atms1花藥絨氈層發育的滯后性越來越嚴重，23℃時僅有小部分絨氈層發育滯后，所以atms1表現為半不育;而在27℃時，幾乎所有的絨氈層均表現為發育滯后，植株不能產生正常成熟的花粉粒，進而導致atms1幾乎完全不育.

2.3 atms1的遺傳背景純化與遺傳分析

atms1與野生型Col-0回交后，F1代表型正常，植株可育，說明該突變體受隱性基因控制.F1代自交得到的F2代群體中出現育性分離，在27℃時，可育植株164株，不育植株56株.經卡方測驗，二者比例為3∶1，符合孟德爾遺傳定理，因此，可以初步確定突變體atms1的溫敏雄性不育表型受單個隱性核基因控制.

3 討論

目前，非脅迫溫度(常溫)敏感型雄性不育系在雜交作物生產中起著越來越重要的作用，鑒定控制這類雄性不育的基因，并且探究其作用機理具有重要的科學意義和巨大的應用前景，但是目前仍然沒有任何一種作物的常溫敏不育基因被克隆鑒定.模式植物擬南芥中，目前只有myb33/myb65雙突變體具有常溫敏雄性不育特征的報道.本實驗室分離到的溫敏雄性不育突變體atms1的育性變化正是屬于該范疇：在相對于擬南芥的低溫16℃培養時，atms1表現出和野生型幾乎一致的可育性;在常規的實驗室培養溫度(23℃)時，atms1的花粉不育率上升為40%，而其果莢的育性降為60%;在高溫27℃時，atms1的花粉不育性上升至80%，果莢則接近完全不育.

與野生型相比，當溫度低于23℃時，atms1的花藥沒有顯著的表型，而當溫度升高至27℃時，atms1的花藥也出現了顯著的表型：其絨氈層發育與同時期的野生型相比要滯后;有些花藥室的絨氈層在花藥壁破裂時仍然保持不降解;atms1花粉母細胞的胼胝體單薄，細胞形狀扭曲，個別細胞開始有降解的跡象;atms1花藥的各個花藥室發育不同步.由于絨氈層對花粉發育至關重要，許多絨氈層發育突變體都有花粉母細胞、或者晚期的小孢子、或者更晚期的花粉在發育過程中逐漸降解的表型.27℃時atms1的花藥切片結果顯示，其絨氈層發育時期明顯滯后于花粉發育時期，這種表型與myb33/myb65雙突變體非常相似.綜合atms1花粉和花藥的表型，可以判斷atms1的基因突變所導致的缺陷影響的是絨氈層的發育，因此atms1是一個絨氈層發育的突變體.

關于受外界環境溫度控制和影響植物生殖能力變化方面的研究，目前還處于起步階段，有關的基因克隆鑒定十分罕見，即使是基礎研究進展最快的擬南芥研究，至今已見報道的也只有3個溫敏雄性不育基因被克隆鑒定.2009年，De Ye實驗室報道了一種擬南芥高溫敏感雄性不育突變體tms1［14］.他們發現，tms1在常規溫度下育性表現和野生型并無不同，而在脅迫高溫30℃下處理2 d后，其育性急劇下降.正如預計，他們發現TMS1基因編碼一種熱休克蛋白，這類蛋白基因的敲除，會使植物的某些發育過程對熱脅迫的抵抗力顯著下降.但是，這類高溫敏感雄性不育突變體只在高溫時才出現顯著的表型，體現了一種植物對熱脅迫的反應.

關于控制植物在常溫下表現為雄性不育的突變體基因已被克隆鑒定的報道，至今為止只有Millar等［15］發現的擬南芥myb33和myb65基因.myb33/ myb65雙突變體在常規擬南芥的實驗室培養溫度下出現半不育特征，而在低溫16℃下育性得到大部分的恢復.值得注意的是，myb33和 myb65都編碼GAMYB家族的轉錄因子，這暗示了轉錄水平的調控在常溫敏雄性不育中，如同外界溫度對開花的控制一樣，可能也起著舉足輕重的作用.此外，由于myb33/myb65雙突變體的細胞質內出現過多的液泡，而使絨氈層也同樣出現了體積膨大的表型，因此，atms1和myb33/myb65是否屬于同種調控途徑的突變體值得進一步探討.

［1］ SIMPSONG G，DEANC.Arabidopsis，the Rosetta Stone of flowering time［J］.Science，2002，296(5566)：285-289.

［2］ MOURADOVA，CREMERF，COUPLANDG.Control of flowering time：interacting pathways as a basis for diversity［J］.Plant Cell，2002，14(S1)：111-130.

［3］ SCOTTR，HODGER，PAULW，et al.The molecular biology of anther differentiation［J］.Plant Sci，1991， 80(1/2)：167-191.

［4］ GOLDBERGR B，BEALST P，SANDERSP M.Anther development：basic principles and practical applications［J］.Plant Cell，1993，5(10)：1217-1229.

［5］ 申岳正，薛光行.光敏不育水稻育性轉換光溫互作模式研究［J］.中國農學通報，1994，10(2)：18-21.

［6］ SURESHKUMARB，DETLEFW.Temperature induced flowering in Arabidopsis thaliana［J］.Plant Signaling＆Behavior，2006，1(5)：227-228.

［7］ LEMPEL，BALASUBRAMANIANS，SURESHKUMARS，et al.Diversity of flowering responses in wild Arabidopsis thaliana strains［J］.PLoS Genet，2005，1(1)：e6.

［8］ BALASUBRAMANIANS，SURESHKUMARS，LEMPEJ，et al.Potent induction of Arabidopsis thaliana flowering by elevated growth temperature［J］.PLoS Genet，2006，2 (7)：e106.

［9］ SURESHKUMARB，SRIDEVIS，JANNEL，et al.Potent induction of Arabidopsis thaliana flowering by elevated growth temperature［J］.PLoS Genet，2006，2(7)：e106.

［10］ BLáZQUEZM A，AHN JH，WEIGELD.A thermosensory pathway controlling flowering time in Arabidopsis thaliana［J］.Nature Genetics，2003，33：168-171.

［11］ KUMARS V，WIGGEP A.H2A.Z-containing nucleosomes mediate the thermosensory response in Arabidopsis［J］.Cell，2010，140(1)：136-147.

［12］ 邱振國.光溫敏核不育水稻研究及利用進展［J］.安徽農業科學，2006，34(20)：5228-5230，5243.

［13］ PAULM S，ANHTHUQ B，KOENW K N，et al.Anther developmental defects in Arabidopsis thaliana male-sterile mutants［J］.Sex Plant Reprod，1999，11：297-322.

［14］ YANGK，XIAC，LIUX，et al.A mutation in Thermosensitive Male Sterile 1，encoding a heat shock protein with DnaJ and PDI domains， leads to thermosensitive gametophytic male sterility in Arabidopsis［J］.Plant Journal，2009，57(5)：870-882.

［15］ MILLARA A，GUBLERF.The Arabidopsis GAMYB-like genes，myb33 and myb65 aremicroRNA-regulated genes，that redundantly facilitate anther development［J］.Plant Cell，2005，17：705-721.