水生實驗動物劍尾魚的DNA指紋圖譜構建

全迎春，劉宇飛，2，白俊杰

（1.中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣州 510380；2.上海靖麗信息科技有限公司，上海 200235）

劍尾魚（Xiphophorus hellerii）又名青劍、劍魚，屬花鳉科（Opecilidae），是小型熱帶淡水魚。具有食性雜、繁殖周期短、適應性強，容易飼養(yǎng)等優(yōu)點［1，2］。研究調(diào)查結果顯示劍尾魚對多種農(nóng)藥、重金屬等毒物較敏感，還對某些魚類病原體敏感性強，以及存在盲眼、畸形等諸多突變性狀，適合作為動物模型［1-3］。1987年，珠江水產(chǎn)研究所開始了劍尾魚實驗動物化研究，通過定向培育和系統(tǒng)研究，育成RRB（紅眼紅體）、RW-H（紅眼白體）、BY-F（黑眼橘紅體）三個品系［1，3］。其中代表品系RR-B系劍尾魚近交達30代，通過了全國水產(chǎn)原種和良種審定委員會審定，農(nóng)業(yè)部第348號公告公布：劍尾魚RR-B系是適用于水環(huán)境監(jiān)測［4］、水產(chǎn)藥物安全性評價［5］、化學品毒性檢測［6］、動物疾病檢驗模型［7］及遺傳生物學研究［8］等領域的水生實驗動物。

傳統(tǒng)的品種鑒定方法存在很多不足，且易受環(huán)境影響、不能鑒定基因混雜程度等，而DNA指紋圖譜直接反映品種之間以及個體之間基因組序列的差異，具有多位點性、高變異性、簡單而穩(wěn)定的遺傳性，近年來引起人們的重視，表現(xiàn)出巨大的實用價值［9］。劍尾魚作為一種重要的水生實驗動物，其種質(zhì)資源的鑒定方法仍有待完善，因此，本研究應用擴增穩(wěn)定、清晰的46個微衛(wèi)星位點，對RR-B系（紅眼紅體）、RW-H系（紅眼白體）、野生種三個品系劍尾魚進行DNA指紋圖譜構建，并將形成的數(shù)字化指紋輸入珠江水產(chǎn)研究所魚類種質(zhì)鑒定軟件V1.0形成種質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)庫。該圖譜不僅能呈現(xiàn)出劍尾魚的遺傳概貌，用于劍尾魚選育系及其野生品種的鑒定，而且也為水生實驗動物劍尾魚的品種選育和知識產(chǎn)權保護提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗魚

RR-B系劍尾魚30尾（雌雄各15尾），從珠江水產(chǎn)研究所水生實驗動物培育基地隨機抽取；RWH系劍尾魚30尾（雌雄各15尾），取自珠江水產(chǎn)研究所水生實驗動物培育基地，已選育至15代；野生型劍尾魚（非選育群體）購自廣州觀賞魚市場。

1.2 基因組DNA樣品的制備

取劍尾魚背鰭約10 mg，參考《分子克隆試驗指南》［10］方法提取基因組DNA。0.8％瓊脂糖電泳檢測DNA的完整性和純度并用紫外分光光度計（Eppendorf BioPhotometer）檢測其濃度，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微衛(wèi)星引物合成、PCR擴增及電泳

參考已報道的文獻［11-12］及劍尾魚中心網(wǎng)站中有關 微 衛(wèi) 星 的 數(shù) 據(jù) （www.xiphophorus.org/-m icrosats/microsat.htm），選取有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物50對，由上海英駿公司合成。PCR反應總體系為10μL，含有10×Buffer 1.0μL，MgCl2（25 mmol/L） 0.3～0.6μL，dNTPs（10 mmol/L）0.2μL，上、下游引物（20 mmol/L）各 0.5μL，Taq酶 0.5 U，模板DNA 50 ng左右。PCR反應程序為94℃預變性3 m in后進入循環(huán)體系，94℃變性30 s，各引物退火溫度48～60℃，退火時間30 s，72℃延伸45 s，25個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。以8％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，取3μL產(chǎn)物電泳，硝酸銀染色，染色方法參照文獻［13］。

1.4 微衛(wèi)星位點的篩選

以8尾野生劍尾魚的 DNA樣本為模板，調(diào)節(jié)PCR的溫度（48℃ ～60℃）、鎂離子濃度（終濃度0.5～1.5 mmol/L），使PCR達到最佳擴增效果。挑選擴增效果穩(wěn)定，電泳條帶清晰的微衛(wèi)星位點用于劍尾魚DNA指紋圖譜的構建。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯帶后用掃描儀掃描，根據(jù)凝膠上DNA泳動距離，用Gel-pro analyzer 4.5軟件分析條帶大小。統(tǒng)計劍尾魚個體在各個位點的條帶大小，用Excel軟件繪制散點圖，從而形成3個群體的指紋圖譜模式圖。選取在3個劍尾魚品系中具有特異擴增條帶的5對微衛(wèi)星引物形成數(shù)字化指紋，以便于3個品系及其雜交種的鑒定。

2 結果

2.1 劍尾魚RR-B系、RW-H系及野生群體的微衛(wèi)星擴增結果

用8尾劍尾魚個體進行預實驗，篩選合成的50對引物，經(jīng)PCR條件優(yōu)化，選取擴增結果穩(wěn)定、條帶清晰的引物，共篩選出46對引物。然后使用這些微衛(wèi)星標記對劍尾魚RR-B系、RW-H系及野生群體進行基因組掃描，46個位點在3個群體中共找到等位基因106個，平均每個位點2.3個，部分擴增結果見圖1。

微衛(wèi)星標記遵循孟德爾遺傳法則，呈共顯性遺傳，因此能很好的區(qū)分純合子和雜合子。如圖1中，微衛(wèi)星位點Msc036具有3種等位基因型，純合個體僅擴增出其中一條帶型，雜合個體則可擴增出其中二條帶型，圖中RR-H系劍尾魚在位點Msc036為純合。結果發(fā)現(xiàn)劍尾魚 RR-B系在42個微衛(wèi)星位點上表現(xiàn)為純合、單態(tài)性，等位基因純合率為91.3％； RW-H系則為43個位點純合、單態(tài)性，等位基因純合率為且為93.5％；而這些野生群體在這些位點（除位點Msb030外）則表現(xiàn)為雜合，反映出這2個選育系已經(jīng)具有了很高的遺傳純度。

圖1 劍尾魚3個群體在微衛(wèi)星位點Msc036的擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoregram of locus Msd036 in three swordtail fish populations

2.2 劍尾魚微衛(wèi)星DNA指紋圖譜模式圖構建

采用Excel軟件，根據(jù)46對微衛(wèi)星引物在3個劍尾魚群體中PCR擴增條帶的大小，繪制劍尾魚微衛(wèi)星DNA指紋圖譜模式圖（見圖2～4）。

圖2 劍尾魚RR-B系的微衛(wèi)星DNA指紋圖譜Fig.2 DNA fingerprinting of RR-B strain of Xiphophorus helleri using Microsatellites

圖3 劍尾魚RW-H系的微衛(wèi)星DNA指紋圖譜Fig.3 DNA fingerprinting of RW-H strain of Xiphophorus helleri using M icrosatellites

圖4 劍尾魚非選育系的微衛(wèi)星DNA指紋圖譜Fig.4 DNA fingerprinting of wild Xiphophorus helleri using Microsatellites

2.3 劍尾魚品系鑒定標記及其數(shù)字化指紋

選取在劍尾魚RR-B系、RW-H系和非選育系中具有特異擴增條帶的5對微衛(wèi)星引物，根據(jù)擴增條帶的大小，有帶的記為1，無帶的記為0，形成每個品系對應的數(shù)字化指紋，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 劍尾魚特異微衛(wèi)星標記的數(shù)字化指紋Tab.1 The digital fingerprint of Xiphophorus helleri on strain-specialm icrosatellite loci

2.4 劍尾魚DNA指紋圖譜鑒定數(shù)據(jù)及軟件應用

珠江水產(chǎn)研究所魚類種質(zhì)鑒定軟件 V1.0 （PRIFRI1.0）是由珠江水產(chǎn)研究所根據(jù)魚類 DNA指紋數(shù)據(jù)特點開發(fā)的魚類種質(zhì)鑒定軟件，已獲得軟件著作權（證書號2010SR026776）。將劍尾魚數(shù)字化指紋數(shù)據(jù)根據(jù)軟件要求整理成DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫（如圖5所示），該軟件可從已建立的劍尾魚指紋圖譜數(shù)據(jù)庫中挑選任意幾個位點所形成的數(shù)字化指紋作為標準，以EXCEL形式導入軟件，應用軟件中已嵌入的計算公式，經(jīng)基因頻率、遺傳相似度等計算，快速準確的鑒定的某一未知個體與各已知品系的相似度并確定其種群分類歸屬。

以劍尾魚RR-B系的第一個個體在其中5個微衛(wèi)星位點（Msa007、Msa008、Msa010、Msa012和Msa014）的數(shù)據(jù)“11000 010 01 010 10000”為例，輸入該軟件后，運行軟件，結果如下圖所示：

圖5 劍尾魚DNA指紋數(shù)據(jù)庫示意圖Fig.5 Part of the DNA fingerprinting database of Xiphophorus helleri

圖6 劍尾魚種質(zhì)資源鑒定軟件的運行示意圖Fig.6 The software operation schematic of Xiphophorus germplasm resources appraisal software，PRIFRI1.0

3 討論

實驗動物是醫(yī)學、生命科學研究的基礎和重要支撐條件，在疾病模型的構建、藥物安全性評價、環(huán)境污染監(jiān)測、發(fā)育生物學、分子生物學等眾多領域發(fā)揮著越來越重要的作用，劍尾魚在應用中具有明顯的特色與優(yōu)勢，具有廣闊的應用前景。近交系動物中微衛(wèi)星長度變化發(fā)生率很低，近交系實驗動物的顯著特征是基因純合性及遺傳穩(wěn)定性，用于實驗重復性好，可比性強，微衛(wèi)星位點的等位基因則可成為某一近交系動物的恒定參數(shù)［14-15］。

劍尾魚種質(zhì)資源監(jiān)測及近交系純度鑒定是劍尾魚作為實驗動物的基礎。微衛(wèi)星DNA是對DNA的直接反應，要比生化標記更準確、可靠，已經(jīng)廣泛應用到大小鼠、倉鼠、沙鼠、家兔、犬、猴和豬等常用實驗動物的遺傳監(jiān)測當中［16-17］。本研究構建的微衛(wèi)星DNA指紋圖譜可以用作劍尾魚品種鑒定，這幾個品系間具有特異擴增條帶的5個微衛(wèi)星標記將較好的用于區(qū)分劍尾魚的不同品系，同時PRIFRI1.0軟件的應用也將簡化種質(zhì)鑒定步驟。另一方面微衛(wèi)星DNA指紋也可用于劍尾魚品系的純度檢測。歐陽兆和等［18］用14個微衛(wèi)星DNA對10個近交系小鼠多態(tài)分析表明，這些微衛(wèi)星DNA在同一品系不同個體間表現(xiàn)為單態(tài)性，在不同品系間表現(xiàn)為多態(tài)性，可快速、經(jīng)濟的對近交系小鼠進行遺傳檢測和純度鑒定。本研究中46個微衛(wèi)星標記擴增的結果顯示，在野生型劍尾魚中表現(xiàn)為多態(tài)性的46個微衛(wèi)星DNA標記，在RR-B系和RW-H系中分別有42和43個標記表現(xiàn)為單態(tài)，基因純合率為91.3％、93.5％。這與李凱彬用生化標記方法檢測出結果一致［8］，也證明了微衛(wèi)星標記在實驗動物遺傳監(jiān)測中應用的可行性。

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