吸煙對(duì)大鼠肺組織B7-1/B7-2及其相關(guān)配體表達(dá)的影響

王 潔，許建英

（山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院呼吸科，太原 030001）

研究表明吸煙可導(dǎo)致肺部慢性炎癥，其發(fā)生發(fā) 展過程可能與免疫系統(tǒng)對(duì)有毒物質(zhì)的調(diào)節(jié)失衡有關(guān)［1］。目前認(rèn)為香煙煙霧中的抗原物質(zhì)可以影響機(jī)體的免疫狀態(tài)，同時(shí)也是引起呼吸道及肺組織病理學(xué)改變的重要因素之一［2］。抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cells，APC）作為機(jī)體免疫反應(yīng)的首要環(huán)節(jié)，可將外源性抗原消化降解成含抗原決定簇的肽鏈，與細(xì)胞膜表面的主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）結(jié)合，形成抗原肽-MHC。此時(shí)APC表面的B7-1、B7-2分子與表達(dá)于T細(xì)胞表面的CD28、CTLA-4分子互相作用，引起特異性免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過研究吸煙對(duì)大鼠肺組織 B7-1/ B7-2及其相關(guān)配體表達(dá)的影響，探討專職APC在吸煙所致肺部慢性炎癥發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

W istar大鼠（山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心提供［SCXK（晉）2009-0001］）；實(shí)驗(yàn)用香煙為芙蓉牌過濾嘴香煙（湖南中煙工業(yè)公司，焦油含量12 mg/支，煙堿量0.1 mg/支）；兔抗B7-1抗體，兔抗B7-2抗體，兔抗CD28抗體，兔抗CTLA-4抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；SABC（兔IgG）試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；DAB顯色劑（北京中杉金橋生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與模型制備：將 30只健康雄性W istar大鼠，體重200±20 g。隨機(jī)分為不吸煙組、吸煙6周組和吸煙12周組，每組10只。吸煙組大鼠放入自制實(shí)驗(yàn)性大鼠被動(dòng)吸煙裝置［3］（自動(dòng)助燃裝置連接密閉玻璃箱）內(nèi)，每次吸煙15支（約2 h），一日2次（上午、下午各1次），每周吸煙6 d，分別吸煙6周和12周。不吸煙大鼠正常飼養(yǎng)12周，與吸煙大鼠飼養(yǎng)條件和環(huán)境相同。

1.2.2 標(biāo)本采集：烏拉坦麻醉后處死動(dòng)物，開胸取肺組織。抽取4％中性甲醛3 m L經(jīng)主支氣管均勻的注入兩肺內(nèi)，并置入4％中性甲醛中固定48 h。石蠟包埋切片，用于HE染色及免疫組化染色。

1.2.3 B7/CD28/CTLA-4免疫組化染色：一抗稀釋濃度為B7-1（1∶200）、B7-2（1∶200）、CD28（1∶300）、CTLA-4（1∶300），陰性對(duì)照以 PBS代替一抗。采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SABC）免疫組化檢測(cè)試劑說(shuō)明書進(jìn)行免疫組化半定量染色。

1.2.4 圖像分析及結(jié)果判斷：用 BX-51型 Olympus顯微鏡及 MISA-2000數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化染色切片進(jìn)行圖像分析。每張切片隨機(jī)選取3個(gè)含有完整支氣管環(huán)的氣道，其內(nèi)腔直徑為400μm～600μm之間。高倍視野下（放大倍數(shù)40×10倍）觀察氣道周圍間質(zhì)中炎癥細(xì)胞的分布情況。采圖（規(guī)格15 cm×18 cm）并隨機(jī)選取3個(gè)氣道周圍面積為3 cm×3 cm大小的肺間質(zhì)作為測(cè)量區(qū)。結(jié)果判斷：細(xì)胞膜周圍出現(xiàn)點(diǎn)狀、片狀或半月形的棕黃色標(biāo)記物為陽(yáng)性單位。排除氣道周圍血管內(nèi)或肺泡內(nèi)免疫組化染色呈棕黃色的陽(yáng)性單位。分別測(cè)量陽(yáng)性單位的積分光密度、平均光密度、平均灰度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間比較用 SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)以橫軸為吸煙時(shí)間，縱軸為平均光密度值（OD），繪制 B7/ CD28/CTLA-4的線性趨勢(shì)圖。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織病理學(xué)改變

HE染色顯示：不吸煙組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，各級(jí)支氣管管腔內(nèi)及肺間質(zhì)中少量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。吸煙6周組可見支氣管纖毛倒伏，出現(xiàn)脫落。小氣道腔內(nèi)出現(xiàn)粘液栓、管壁充血水腫，支氣管腔內(nèi)和肺間質(zhì)中可見淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。吸煙12周組肺支氣管周圍平滑肌束增厚肥大或斷裂萎縮，管腔纖毛柱狀上皮細(xì)胞脫落或變性。支氣道腔內(nèi)及肺間質(zhì)中可見炎性細(xì)胞，以巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞居多，部分氣道出現(xiàn)粘液栓。肺泡間隔纖維樣改變，出現(xiàn)肺泡融合形成肺大皰。

2.2 B7/CD28/CTLA-4免疫組化染色

2.2.1 免疫組化陽(yáng)性結(jié)果描述：兩組吸煙大鼠支氣管、血管周圍及肺間質(zhì)中可見不同程度表達(dá)為陽(yáng)性的炎癥細(xì)胞，B7-1、B7-2的表達(dá)以巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主，CD28、CTLA-4的表達(dá)以淋巴細(xì)胞為主。不吸煙組大鼠表達(dá)為陽(yáng)性的炎癥細(xì)胞較少（見彩插3圖1）。

2.2.2 半定量結(jié)果分析：吸煙6周組與吸煙12周組大鼠肺組織 B7-1、B7-2、CD28、CTLA-4表達(dá)量較不吸煙組均顯著增高（P＜0.01），吸煙12周組較吸煙6周組各指標(biāo)的表達(dá)量也均增高（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表1）。

表1 B7-1/B7-2及其相關(guān)配體CD28/CTLA-4的表達(dá)量（OD值） Tab.1 The expression of B7-1/B7-2 and its associated ligands CD28/CTLA-4 in chronic pulmonary inflammation

2.2.3 B7/CD28/CTLA-4變化趨勢(shì)：B7-1與 B7-2的表達(dá)量隨吸煙時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)且線形相近。CD28和CTLA-4的表達(dá)量隨吸煙時(shí)間的延長(zhǎng)也呈上升趨勢(shì)，吸煙6周時(shí)CD28表達(dá)量上升趨勢(shì)較CTLA-4緩慢；吸煙12周時(shí)CD28表達(dá)量上升趨勢(shì)較CTLA-4快。（見圖2）

圖2 B7/CD28/CTLA-4的趨勢(shì)線形圖Fig.2 The changed Trend of B7/CD28/CTLA-4

3 討論

每支香煙燃燒時(shí)能產(chǎn)生大約4700多種化學(xué)物質(zhì)［4］，其中有相當(dāng)一部分是有害的，如香煙煙霧中的抗原物質(zhì)煙草糖蛋白，作為外源性抗原物質(zhì)進(jìn)入呼吸道內(nèi)，在肺組織中形成或出現(xiàn)新的抗原表位。再由肺部專職APC（樹突細(xì)胞、肺巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和肺部嗜酸性粒細(xì)胞）通過抗原肽-MHC和共刺激分子將抗原信息傳遞給T細(xì)胞，使T細(xì)胞活化增殖。其中B7/CD28/CTLA-4被認(rèn)為是激活T細(xì)胞作用效果最強(qiáng)的共刺激分子。

有研究表明B7-1、B7-2分子共有25％的氨基酸同源序列，但不論T細(xì)胞活化階段還是組織分布上這兩種分子在 APC上的表達(dá)和分布均不同［5］。正常靜息狀態(tài)下APC幾乎不表達(dá) B7-1，巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞及樹突細(xì)胞則表達(dá)較少的 B7-2。在抗原刺激下，活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞B7-1和 B7-2表達(dá)水平都明顯增高［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不吸煙組氣道間質(zhì)組織中巨噬細(xì)胞與淋巴細(xì)胞細(xì)胞膜表面B7-1和B7-2表達(dá)呈弱陽(yáng)性，吸煙6周組和吸煙12周組B7-1及B7-2表達(dá)水平較不吸煙組明顯增高，但隨吸煙時(shí)間延長(zhǎng)兩者的增高趨勢(shì)相似但并不完全相同。由此推測(cè)，APC表面的B7分子與 T淋巴細(xì)胞表面的CD28/CTLA-4結(jié)合的氨基酸序列及結(jié)合速率均不同。

CD28/CTLA-4是一對(duì)具有正負(fù)調(diào)節(jié)功能的共刺激分子。CD28在調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化增殖的過程中起著極其重要的作用，與B7結(jié)合后可促進(jìn)T細(xì)胞抗原受體（T cell antigen receptor，TCR）介導(dǎo)細(xì)胞增殖，防止TCR誘導(dǎo) T細(xì)胞進(jìn)入無(wú)反應(yīng)狀態(tài)［5］。CD28能調(diào)節(jié)并維持適量的、有功能的T細(xì)胞存活以保證特異性免疫應(yīng)答存在，同時(shí)也可通過細(xì)胞因子激活CTLA-4維持免疫過程的平衡和穩(wěn)定。CTLA-4與B7結(jié)合的親和系數(shù)是 CD28的20～150倍［7］，有利于炎癥早期抗原刺激較少時(shí)，APC表面 B7分子與CTLA-4結(jié)合并抑制T細(xì)胞激活。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：吸煙6周組，CD28表達(dá)量上升緩慢，CTLA-4表達(dá)量與之相比上升趨勢(shì)較快；吸煙12周組，CD28表達(dá)量上升趨勢(shì)較快，CTLA-4上升趨勢(shì)較平緩。B7表達(dá)量增高的同時(shí)CD28和CTLA-4表達(dá)量也有所增高。提示炎癥初期CTLA-4表達(dá)增高，并可能與CD28競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合B7分子從而抑制T細(xì)胞活化增殖，可下調(diào)或終止T細(xì)胞的反應(yīng)。隨著炎癥反應(yīng)的進(jìn)展 CD28與B7結(jié)合占優(yōu)勢(shì)使T細(xì)胞逐漸被激活。盡管本實(shí)驗(yàn)大鼠B7/CD28/CTLA-4（吸煙12周內(nèi)）在肺部慢性炎癥發(fā)生發(fā)展中表達(dá)呈增高趨勢(shì)，但有研究顯示隨著免疫耐受和炎癥介質(zhì)引起抗原提呈功能受限等問題出現(xiàn)，共刺激分子的表達(dá)不會(huì)無(wú)限制增高［8］。

B7/CD28/CTLA-4為APC激活T細(xì)胞的必要途徑，進(jìn)而動(dòng)員炎癥反應(yīng)、進(jìn)一步激活輔助B細(xì)胞、發(fā)揮細(xì)胞毒作用，從而產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子。在肺組織中可刺激上皮細(xì)胞、破壞氣道纖毛系統(tǒng)及上皮屏障、激發(fā)氣道和肺組織慢性炎癥。本實(shí)驗(yàn)中即可見吸煙組大鼠氣道上皮倒伏、脫落、杯狀細(xì)胞數(shù)增多，部分氣道出現(xiàn)鱗狀上皮化生。氣道、血管周圍及肺泡內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。小氣道肌層萎縮或肥大、肺泡結(jié)構(gòu)破壞形成肺大皰并出現(xiàn)肺組織纖維化。由此可見，B7/CD28/CTLA-4作用機(jī)制可能參與了肺部慢性炎癥及其所引起的病理學(xué)改變。

綜上所述，吸煙可引起大鼠肺組織 B7/CD28/ CTLA-4表達(dá)水平的增高，促進(jìn)或抑制T細(xì)胞的活化增殖以調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，提示APC可能在吸煙所致肺部慢性炎癥發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。這也為臨床上阻斷或延緩吸煙所致的肺部慢性炎癥的進(jìn)程提供了新的治療思路，但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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