IL34轉基因小鼠的建立和表型分析

楊 青，全雄志，廉 虹，張 旭，馬春梅，張連峰

（中國醫學科學院，北京協和醫學院，醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

白介素最早發現在白細胞中表達作為細胞間信號傳遞，可以由多種細胞產生，不但參與調節免疫應答還廣泛參與調節機體的生理病理過程。迄今發現并命名的白介素家族的成員共有37種，它們存在于多種組織中，具有廣泛的生物學活性。白介素34（Interleukin34，IL34）是2008年Haishan Lin等發現的細胞因子［1］，它可以與在單核細胞表面的表達的集落刺激因子受體（colony stimulating factor 1 receptor，CSF1R）結合，促進骨髓中巨噬細胞集落的形成。IL34在脾中有高表達，提示該基因對免疫系統有一定的作用，但其作用機制尚不清楚。本研究通過轉基因技術，將人IL34基因轉入C57BL/6J小鼠，建立了人IL34轉基因小鼠，為進一步研究 IL34的作用建立了模型。

1 材料和方法

1.1 IL34表達載體的構建及轉基因

從Origene公司購買人IL34質粒，以EcoRⅠ和NotⅠ酶切質粒，膠回收IL34基因片段，然后將該片段插入到從Origene公司購買的pCMV-MIR載體中CMV啟動子的下游，構建 IL34轉基因載體。提取并酶切鑒定質粒正確后，用 Tth111I將其線性化，SephedexG50柱純化 DNA片段，獲得 CMV啟動的IL34基因的轉基因片段，注射前將轉基因片段的濃度調整至5 ng/uL，用顯微注射法［2］將線性化的轉基因表達載體注射到 C57BL/6J小鼠的受精卵中（小鼠購自康藍公司［SCXK（京）2004001］），用ICR小鼠作假孕受體（本實驗室飼養），制備轉基因小鼠（TE2000-U顯微注射儀）。實驗中涉及動物的操作程序已經得到中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為GC-08-2036。

1.2 PCR鑒定IL34轉基因動物的基因型

轉基因小鼠在出生9～14 d用剪趾法標記，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組DNA［3］，用PCR檢測IL34轉基因小鼠，PCR引物為（上海英濰捷基貿易有限公司，中國），PCR試劑購自寶生物工程有限公司，中國。PCR 上游引物為 5＇GTCAATGGGTGGAGTATTTACG，下游引物為 5＇GCTTATATAGACCTCCCACCGT。反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環。IL34片段為386 bp。

1.3 W estern b lotting鑒定IL34基因在蛋白水平的表達

選用1月齡的轉基因陽性和同窩陰性小鼠，頸椎脫臼法犧牲小鼠，迅速取出脾組織置勻漿器中，加入1 m L的RIPA蛋白裂解液，將組織勻漿破碎后靜置30 m in，然后4℃，1300 rpm離心30 min，取上清液即為脾組織總蛋白。BCA法測定濃度，取等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，隨后將蛋白轉移至PVDF膜，5％脫脂奶粉室溫封閉30 m in。用 TBST以1：1000濃度稀釋棉羊抗人IL34單抗，將一抗與膜封入雜交袋中，4℃過夜。棄去一抗，TBST洗膜3次，每次10 min。用TBST以1：20000濃度稀釋辣根過氧化物酶標記的兔抗綿羊 IgG，同時加入 β-actin抗體于雜交盒中，放入膜，室溫搖床孵育1 h。棄去二抗TBST洗膜3次，每次10 min。將膜至于化學發光劑中，曝光、顯影及定影。

1.4 IL34轉基因小鼠的病理學檢測

選用2月齡IL34轉基因小鼠和同窩陰性小鼠，頸椎脫臼法犧牲小鼠，取心、肝、脾、肺、腎、腦及小腸等重要器官然后用10％福爾馬林溶液中固定48 h，進行取材、脫水、包埋、切片、HE染色及光鏡下觀察（Nikon顯微鏡，日本）。

2 結果

2.1 IL34表達載體的構建和轉基因小鼠基因表型的鑒定

從Origenen購買的人IL34質粒（GenBank No.NM_152456）。將該基因酶切回收后插入從Origene公司購買的pCMV-MIR載體中CMV啟動子的下游，構建IL34轉基因表達載體（圖1）。

圖1 IL34轉基因表達載體Fig.1 IL34 transgenic construct

用顯微注射法將線性化的轉基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，轉入到假孕受體ICR小鼠中，小鼠出生后9 d提取基因組DNA，用PCR擴增IL34目的基因386 bp的片段來鑒定IL34轉基因小鼠（圖2），共得到5只首建鼠，均可傳代，留下兩個表型明顯的保種。

2.2 W estern b lotting檢測IL34基因在蛋白水平的表達

分別提取出生1月齡的轉基因小鼠和同窩陰性小鼠的脾組織總蛋白，用人 IL34單克隆抗體進行Western blotting分析，結果顯示有 2個 Founder的F1代有人 IL34高表達，分別為13和24首建鼠。IL34蛋白分子量大小為27×103。

圖2 PCR鑒定IL34轉基因動物的凝膠電泳分析1、空白對照；2、陰性對照；3、陽性對照； 4、DNA分子量標記DL2000；5、6、8、10、12 F1代轉基因小鼠；7、9、11 F1代陰性小鼠Fig.2 Genotyping of the transgenic mice with PCR Lane 1 was blank control；Lane 2 was negative control； Lane 3 was positive control；Lane 4 was DNA molecular weightmarker（DL2000）；Lane 5，6，8，10 and 12 werethe positive transgenic mice；Lane 7，9 and 11 were negative controls

圖3 人IL34蛋白在IL34轉基因小鼠脾組織中的表達1號野生型小鼠；2、3號陽性小鼠；用β-actin作為內對照Fig.3 The column Fig.re of different lesions in different age groups Expression of human IL34 in the transgenic spleen The Lane 1 was the wild type spleed.The lane 2 and 3 were samples from the transgenic spleed of founder 13 and founder 24.The same NC membrane was normalized withβ-actin

2.3 病理學檢測

將2月齡IL34轉基因小鼠和同窩陰性小鼠的重要器官進行病理解剖，HE染色高倍鏡下可觀察到IL34轉基因小鼠的脾臟中白髓比較活躍，白髓范圍比對照鼠大（彩插4圖 4），其他組織沒有明顯變化。

3 討論

白介素最早發現其主要作用是激活和調節免疫細胞，參與免疫調節過程。但隨著研究的不斷深入，發現白介素還廣泛地參與調節機體的生理病理過程。白介素的重要作用越來越受到研究者們的關注，迄今為止人們發現并命名了37種白介素細胞因子［4］。IL34是2008年Haishan Lin等［1］發現的又一白介素家族成員，它可以與CD14+單核細胞特異性結合，促進單核細胞的增殖和分化。通過功能篩選還證明了IL34是 CSF1R的配體，和CSF1R另一個配體巨噬細胞集落刺激因子（macrophage-colony stimulating factor，M-CSF1）的功能相似，IL34也能刺激骨髓中單核母細胞向巨噬細胞分化［5］。M-CSF在炎癥反應的細胞因子調節網絡中起著非常重要的作用，在各種炎性和自身免疫性疾病如風濕性關節炎［6］、腎炎［7，8］、肺炎［9］、動脈粥樣硬化［10］、骨巨細胞瘤［11］等重大疾病中都起到了重要的作用。IL34是近兩年才發現的細胞因子，生物活性與 MCSF相似［12］，但促巨噬細胞分化的能力低于 MCSF，且其功能以及對各種疾病的調節作用還未明確。最近兩年對 IL34的研究都是集中在體外研究或者使用重組 IL34進行體內研究［13］，而且其使用量遠遠超過了機體內的生理濃度，維持時間短等特點，因此我們建立了 IL34轉基因小鼠，為研究內源性IL34對機體的作用提供了很好的模型。

在本研究中，首建鼠F13和F24的后代小鼠，PCR結果顯示了外源基因能穩定地按孟德爾規則傳遞到下代。Western blot結果顯示IL34基因的表達量在F13和F24轉基因小鼠的脾組織中與野生型小鼠的相比顯著增高，表明成功建立了IL34轉基因小鼠。通過病理學檢測發現，IL34轉基因小鼠的脾臟的白髓區域比較活躍，白髓范圍比野生型小鼠的大。說明免疫細胞增生活躍，提示IL34對免疫系統有一定的作用，但其機制尚未清楚。因此，IL34小鼠的建立，為進一步對內源性IL34的生物學功能及對機體免疫系統的調節作用機制提供很好的實驗依據。

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