維藥鷹嘴豆中金屬硫蛋白提取液對腫瘤細胞的抑制作用

于立博 龔建福 劉繼文 (新疆醫科大學公共衛生學院，新疆 烏魯木齊 830011)

維藥鷹嘴豆中金屬硫蛋白提取液對腫瘤細胞的抑制作用

于立博 龔建福 劉繼文 (新疆醫科大學公共衛生學院，新疆 烏魯木齊 830011)

目的 研究鷹嘴豆金屬硫蛋白(MT)體外抑制腫瘤的效果。方法 將人肺癌細胞株(A549)、人胃癌細胞株(MGC-803)、人乳腺癌細胞株(Bcap-37)進行傳代培養，將提取的鷹嘴豆MT配制成5個濃度組:0.010 0、0.005 0、0.001 0、0.000 5、0.000 1 g/ml，空白對照組和本底對照組。觀察腫瘤細胞的抑制率和凋亡率。結果 與空白對照組比較，0.010 0、0.005 0、0.001 0 g/ml三個濃度組的腫瘤抑制率和細胞凋亡率均增加。結論鷹嘴豆MT可抑制腫瘤細胞增長，促進腫瘤細胞凋亡。

腫瘤細胞;體外培養;鷹嘴豆金屬硫蛋白

金屬硫蛋白(MT)是一類低分子量、富含半胱氨酸的金屬結合蛋白。1957年Margoshes和Valles在研究鎘的生物學作用時，分離出該物質。MT具有廣泛的生理功能，MT的應用研究已成為一個新熱點，其中MT與腫瘤的關系，其在腫瘤細胞中的表達規律及其在腫瘤治療中的應用已經成為該領域研究的焦點。目前研究發現幾乎所有動植物組織(哺乳動物結締組織除外)、原核、真核微生物中均能分離出MT。本實驗主要觀察維藥鷹嘴豆中植物MT提取液體外抑制腫瘤的作用，為今后的藥食兼用植物開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 滅菌胎牛血清(FBS，500 ml，Gibco，批號:05030313L6)，DMEM 粉(Gibco，批號:12100-046)，胰蛋白酶(美國，DIFCO Laboratories)，酶聯免疫檢測儀(美國Bio-RAD公司，∑960)。流式細胞儀(美國Becton-Dickinson，型號:FACSVantageSE)。

1.2 鷹嘴豆MT制備 新疆木壘縣當年產鷹嘴豆，由新疆農科院種子供應站提供。將鷹嘴豆種子風干磨碎過80目篩，加入0.1 mol/L，pH8.6的Tris-HCl緩沖液后采用超聲充分破碎，后于4℃冰箱過夜抽提。于4℃抽提，10 000 r/min離心30 min，收集上清液。上清液于100℃水浴加熱2～3 min，后于4℃下10 000 r/min離心20 min。收集上清液，加入3倍體積的－20℃的預冷無水乙醇，過夜沉淀后，于4℃下12 000 r/min離心20 min。取沉淀加入5ml0.01mol/L Tris-HCl緩沖液溶解數小時，然后在4℃下15 000 r/min離心20 min，收集上清液即MT提取液，將以上提取液于－20℃下冷凍30 h后，放入冷凍干燥機制成凍干粉備用。

1.3 受試細胞培養 人肺癌細胞株(A549)、人胃癌細胞株(MGC-803)、人乳腺癌細胞株(Bcap-37)均由中科院上海細胞生物研究所細胞庫提供。將A549、MGC-803、Bcap-37常規培養于25 cm培養瓶中，每2～3 d換1次液，每2～3 d傳代1次。

1.4 鷹嘴豆MT體外抑瘤實驗 實驗組分為0.010 0、0.005 0、0.001 0、0.000 5、0.000 1 g/ml 5 個濃度組(用 5%DMEM培養液溶解MT凍干粉配制)、空白對照組(含同一細胞密度的培養液)和本底對照組(等體積含相應濃度的MT凍干粉的無細胞培養液)。取處于對數生長期、狀態良好的細胞進行酶聯免疫檢測，細胞生長抑制率=〔(空白對照組A均值-實驗組A均值)/空白對照組A均值〕×100%。同時取以上對數期細胞分別用0.25%胰蛋白酶消化傳代后待細胞長到70%～80%滿度時，用移液槍小心吸棄舊培養液，加入含有不同濃度受試物(濃度為0.01，0.005 g/ml)的培養液繼續培養24 h，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2 結果

2.1 細胞活力測定結果 對于Bcap-37細胞株，當MT濃度分別為:0.000 1、0.000 5、0.001 0、0.005 0、0.010 0 g/ml時，各濃度組的A值均明顯低于空白對照組(P＜0.05);對于A549細胞株，當受試物濃度分別為:0.001 0、0.005 0、0.010 0 g/ml時，各濃度組的A值均顯著低于空白對照組(P＜0.05)，而0.000 1與0.000 5 g/ml濃度組的A值與空白對照組比較無顯著差異(P＞0.05);對 MGC-803細胞株，受試物濃度為:0.000 5、0.001 0、0.005 0、0.010 0 g/ml時，各濃度組A值明顯低于空白對照組(P＜0.05)，而濃度為0.000 1 g/m l組的A值與空白對照組比較無顯著差異(P＞0.05)。見表1。

2.2 細胞凋亡情況的測定 用AV(AnnexinⅤ-FITC)和碘化丙啶(PI)雙染 A549、MGC-803、Bcap-37，通過流式細胞儀測定細胞凋亡情況，見表2和圖1。用0.010 0和0.005 0 g/ml鷹嘴豆MT干預24 h后，三種癌細胞的凋亡率均明顯高于空白對照組(P＜0.01)，其中干預效果最好的是MGC-803，凋亡率達到了28.60%，說明胃癌MGC-803細胞對受試物更敏感。

表1 鷹嘴豆MT對腫瘤細胞生長的影響(±s)

表1 鷹嘴豆MT對腫瘤細胞生長的影響(±s)

與空白對照組比較:1)P＜0.05，下表同

組別(g/ml) A值抑制率(%)Bcap-37 A549 MGC-803空白對照組Bcap-37 A549 MGC-803 0.445±0.038 0.376±0.019 23.34 3.68 5.05 0.407±0.018 0.462±0.025 0.396±0.041 － － －0.010 0 0.154±0.0251) 0.148±0.0101) 0.196±0.0231) 62.16 67.97 50.50 0.005 0 0.201±0.0111) 0.265±0.0181) 0.211±0.0251) 50.61 42.64 46.72 0.001 0 0.253±0.0281) 0.352±0.0631) 0.256±0.0251) 38.57 23.80 35.36 0.000 5 0.300±0.0581) 0.420±0.047 0.350±0.0161) 24.29 9.13 11.62 0.000 1 0.312±0.0211)

表2 鷹嘴豆MT對腫瘤細胞凋亡的影響(±s，%)

表2 鷹嘴豆MT對腫瘤細胞凋亡的影響(±s，%)

組別(g/ml)Bcap-37 A549 MGC-803空白對照組5.70±0.31 0.10±0.01 4.40±0.11 0.005 0 15.00±1.311) 20.50±1.21 14.06±1.241)0.010 0 22.70±1.231) 21.70±1.151) 28.60±1.451)

圖1 不同濃度鷹嘴豆MT對Bcap-37、A549和MGC-803細胞凋亡的流式細胞術分析

3 討論

MT是人體內重要的自由基清除劑，其清除自由基的能力是谷胱甘肽的800倍。哺乳動物細胞內自發性基因突變是導致內源性損傷最重要的原因，而基因突變是腫瘤發生的重要原因。腫瘤的發生是一個復雜的過程，既與細胞增殖過度有關，又與細胞凋亡不足有關〔2〕。本實驗結果表明，鷹嘴豆MT具有顯著抑制腫瘤細胞作用，且具有明顯的劑量依賴性。除了極低濃度組對A549、MGC-803兩種癌細胞未見抑制作用外，其他濃度組均有抑制作用，其中對Bcap-37和MGC-803的抑制作用較強，對A549細胞最高濃度(0.010 0 g/ml)具有較強的抑制效果，抑制率達到了67.97%。說明鷹嘴豆 MT對 Bcap-37和MGC-803細胞的抑制作用更敏感。通過流式細胞儀測定細胞凋亡情況，發現鷹嘴豆MT對3種瘤細胞的凋亡均有促進作用，其作用機制有待進一步闡明。

傳統的放療、化療和生物治療手段對腫瘤早期治療效果顯著，但是腫瘤一旦發生轉移便會給治療帶來極大困難。化療、放療對腫瘤患者的體液免疫和細胞免疫功能都有不同程度的損害，腫瘤患者化、放療后的NK細胞活性、免疫球蛋白水平以及T細胞總數都有明顯下降，其中 CD8的值明顯升高〔3〕。因此，尋找高效低毒的抗腫瘤物質仍是當前的主要研究方向。

本實驗選用目前最常見3種癌細胞菌株作為受試物，觀察鷹嘴豆MT的體外抑制腫瘤效果，雖然具有一定的代表性，但不是很全面，不能代表所有的腫瘤類型，所以在進一步的實驗中應該對各種類型的癌細胞進行全面的實驗，以期全面了解外源性植物MT對腫瘤的治療效果，為今后MT的進一步開發利用提供理論依據。

1 包怡紅，李銳達，梁 雪，等.乳清蛋白肽對衰老小鼠抗氧化能力的影響〔J〕.營養學報，2010;32(3):239-41.

2 彭新顏，孔保華，熊幼翎.乳清多肽對D-半乳糖衰老模型大鼠血清和臟器組織抗氧化效果的影響〔J〕.食品科學，2010;31(9):238-42.

3 彭新顏，孔保華，熊幼翎.乳清蛋白抗氧化肽對H2O2所致人胚肺成纖維細胞MRC-5過氧化損傷的保護作用〔J〕.中國農業科學，2010;43(14):2982-9.

R73

A

1005-9202(2011)12-2242-02

新疆維吾爾自治區教育廳重點項目(No.XJEDU2005I16)

于立博(1974-)，女，碩士，講師，主要從事營養與疾病研究。

〔2011-01-13收稿 2011-04-08修回〕

(編輯 張 慧)