維藥鷹嘴豆中金屬硫蛋白提取液對腫瘤細胞的抑制作用

于立博 龔建福 劉繼文 (新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，新疆 烏魯木齊 830011)

維藥鷹嘴豆中金屬硫蛋白提取液對腫瘤細胞的抑制作用

于立博 龔建福 劉繼文 (新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，新疆 烏魯木齊 830011)

目的 研究鷹嘴豆金屬硫蛋白(MT)體外抑制腫瘤的效果。方法 將人肺癌細胞株(A549)、人胃癌細胞株(MGC-803)、人乳腺癌細胞株(Bcap-37)進行傳代培養(yǎng)，將提取的鷹嘴豆MT配制成5個濃度組:0.010 0、0.005 0、0.001 0、0.000 5、0.000 1 g/ml，空白對照組和本底對照組。觀察腫瘤細胞的抑制率和凋亡率。結(jié)果 與空白對照組比較，0.010 0、0.005 0、0.001 0 g/ml三個濃度組的腫瘤抑制率和細胞凋亡率均增加。結(jié)論鷹嘴豆MT可抑制腫瘤細胞增長，促進腫瘤細胞凋亡。

腫瘤細胞;體外培養(yǎng);鷹嘴豆金屬硫蛋白

金屬硫蛋白(MT)是一類低分子量、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白。1957年Margoshes和Valles在研究鎘的生物學作用時，分離出該物質(zhì)。MT具有廣泛的生理功能，MT的應用研究已成為一個新熱點，其中MT與腫瘤的關系，其在腫瘤細胞中的表達規(guī)律及其在腫瘤治療中的應用已經(jīng)成為該領域研究的焦點。目前研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有動植物組織(哺乳動物結(jié)締組織除外)、原核、真核微生物中均能分離出MT。本實驗主要觀察維藥鷹嘴豆中植物MT提取液體外抑制腫瘤的作用，為今后的藥食兼用植物開發(fā)應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 滅菌胎牛血清(FBS，500 ml，Gibco，批號:05030313L6)，DMEM 粉(Gibco，批號:12100-046)，胰蛋白酶(美國，DIFCO Laboratories)，酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Bio-RAD公司，∑960)。流式細胞儀(美國Becton-Dickinson，型號:FACSVantageSE)。

1.2 鷹嘴豆MT制備 新疆木壘縣當年產(chǎn)鷹嘴豆，由新疆農(nóng)科院種子供應站提供。將鷹嘴豆種子風干磨碎過80目篩，加入0.1 mol/L，pH8.6的Tris-HCl緩沖液后采用超聲充分破碎，后于4℃冰箱過夜抽提。于4℃抽提，10 000 r/min離心30 min，收集上清液。上清液于100℃水浴加熱2～3 min，后于4℃下10 000 r/min離心20 min。收集上清液，加入3倍體積的－20℃的預冷無水乙醇，過夜沉淀后，于4℃下12 000 r/min離心20 min。取沉淀加入5ml0.01mol/L Tris-HCl緩沖液溶解數(shù)小時，然后在4℃下15 000 r/min離心20 min，收集上清液即MT提取液，將以上提取液于－20℃下冷凍30 h后，放入冷凍干燥機制成凍干粉備用。

1.3 受試細胞培養(yǎng) 人肺癌細胞株(A549)、人胃癌細胞株(MGC-803)、人乳腺癌細胞株(Bcap-37)均由中科院上海細胞生物研究所細胞庫提供。將A549、MGC-803、Bcap-37常規(guī)培養(yǎng)于25 cm培養(yǎng)瓶中，每2～3 d換1次液，每2～3 d傳代1次。

1.4 鷹嘴豆MT體外抑瘤實驗 實驗組分為0.010 0、0.005 0、0.001 0、0.000 5、0.000 1 g/ml 5 個濃度組(用 5%DMEM培養(yǎng)液溶解MT凍干粉配制)、空白對照組(含同一細胞密度的培養(yǎng)液)和本底對照組(等體積含相應濃度的MT凍干粉的無細胞培養(yǎng)液)。取處于對數(shù)生長期、狀態(tài)良好的細胞進行酶聯(lián)免疫檢測，細胞生長抑制率=〔(空白對照組A均值-實驗組A均值)/空白對照組A均值〕×100%。同時取以上對數(shù)期細胞分別用0.25%胰蛋白酶消化傳代后待細胞長到70%～80%滿度時，用移液槍小心吸棄舊培養(yǎng)液，加入含有不同濃度受試物(濃度為0.01，0.005 g/ml)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 細胞活力測定結(jié)果 對于Bcap-37細胞株，當MT濃度分別為:0.000 1、0.000 5、0.001 0、0.005 0、0.010 0 g/ml時，各濃度組的A值均明顯低于空白對照組(P＜0.05);對于A549細胞株，當受試物濃度分別為:0.001 0、0.005 0、0.010 0 g/ml時，各濃度組的A值均顯著低于空白對照組(P＜0.05)，而0.000 1與0.000 5 g/ml濃度組的A值與空白對照組比較無顯著差異(P＞0.05);對 MGC-803細胞株，受試物濃度為:0.000 5、0.001 0、0.005 0、0.010 0 g/ml時，各濃度組A值明顯低于空白對照組(P＜0.05)，而濃度為0.000 1 g/m l組的A值與空白對照組比較無顯著差異(P＞0.05)。見表1。

2.2 細胞凋亡情況的測定 用AV(AnnexinⅤ-FITC)和碘化丙啶(PI)雙染 A549、MGC-803、Bcap-37，通過流式細胞儀測定細胞凋亡情況，見表2和圖1。用0.010 0和0.005 0 g/ml鷹嘴豆MT干預24 h后，三種癌細胞的凋亡率均明顯高于空白對照組(P＜0.01)，其中干預效果最好的是MGC-803，凋亡率達到了28.60%，說明胃癌MGC-803細胞對受試物更敏感。

表1 鷹嘴豆MT對腫瘤細胞生長的影響(±s)

表1 鷹嘴豆MT對腫瘤細胞生長的影響(±s)

與空白對照組比較:1)P＜0.05，下表同

組別(g/ml) A值抑制率(%)Bcap-37 A549 MGC-803空白對照組Bcap-37 A549 MGC-803 0.445±0.038 0.376±0.019 23.34 3.68 5.05 0.407±0.018 0.462±0.025 0.396±0.041 － － －0.010 0 0.154±0.0251) 0.148±0.0101) 0.196±0.0231) 62.16 67.97 50.50 0.005 0 0.201±0.0111) 0.265±0.0181) 0.211±0.0251) 50.61 42.64 46.72 0.001 0 0.253±0.0281) 0.352±0.0631) 0.256±0.0251) 38.57 23.80 35.36 0.000 5 0.300±0.0581) 0.420±0.047 0.350±0.0161) 24.29 9.13 11.62 0.000 1 0.312±0.0211)

表2 鷹嘴豆MT對腫瘤細胞凋亡的影響(±s，%)

表2 鷹嘴豆MT對腫瘤細胞凋亡的影響(±s，%)

組別(g/ml)Bcap-37 A549 MGC-803空白對照組5.70±0.31 0.10±0.01 4.40±0.11 0.005 0 15.00±1.311) 20.50±1.21 14.06±1.241)0.010 0 22.70±1.231) 21.70±1.151) 28.60±1.451)

圖1 不同濃度鷹嘴豆MT對Bcap-37、A549和MGC-803細胞凋亡的流式細胞術分析

3 討論

MT是人體內(nèi)重要的自由基清除劑，其清除自由基的能力是谷胱甘肽的800倍。哺乳動物細胞內(nèi)自發(fā)性基因突變是導致內(nèi)源性損傷最重要的原因，而基因突變是腫瘤發(fā)生的重要原因。腫瘤的發(fā)生是一個復雜的過程，既與細胞增殖過度有關，又與細胞凋亡不足有關〔2〕。本實驗結(jié)果表明，鷹嘴豆MT具有顯著抑制腫瘤細胞作用，且具有明顯的劑量依賴性。除了極低濃度組對A549、MGC-803兩種癌細胞未見抑制作用外，其他濃度組均有抑制作用，其中對Bcap-37和MGC-803的抑制作用較強，對A549細胞最高濃度(0.010 0 g/ml)具有較強的抑制效果，抑制率達到了67.97%。說明鷹嘴豆 MT對 Bcap-37和MGC-803細胞的抑制作用更敏感。通過流式細胞儀測定細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆MT對3種瘤細胞的凋亡均有促進作用，其作用機制有待進一步闡明。

傳統(tǒng)的放療、化療和生物治療手段對腫瘤早期治療效果顯著，但是腫瘤一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移便會給治療帶來極大困難。化療、放療對腫瘤患者的體液免疫和細胞免疫功能都有不同程度的損害，腫瘤患者化、放療后的NK細胞活性、免疫球蛋白水平以及T細胞總數(shù)都有明顯下降，其中 CD8的值明顯升高〔3〕。因此，尋找高效低毒的抗腫瘤物質(zhì)仍是當前的主要研究方向。

本實驗選用目前最常見3種癌細胞菌株作為受試物，觀察鷹嘴豆MT的體外抑制腫瘤效果，雖然具有一定的代表性，但不是很全面，不能代表所有的腫瘤類型，所以在進一步的實驗中應該對各種類型的癌細胞進行全面的實驗，以期全面了解外源性植物MT對腫瘤的治療效果，為今后MT的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 包怡紅，李銳達，梁 雪，等.乳清蛋白肽對衰老小鼠抗氧化能力的影響〔J〕.營養(yǎng)學報，2010;32(3):239-41.

2 彭新顏，孔保華，熊幼翎.乳清多肽對D-半乳糖衰老模型大鼠血清和臟器組織抗氧化效果的影響〔J〕.食品科學，2010;31(9):238-42.

3 彭新顏，孔保華，熊幼翎.乳清蛋白抗氧化肽對H2O2所致人胚肺成纖維細胞MRC-5過氧化損傷的保護作用〔J〕.中國農(nóng)業(yè)科學，2010;43(14):2982-9.

R73

A

1005-9202(2011)12-2242-02

新疆維吾爾自治區(qū)教育廳重點項目(No.XJEDU2005I16)

于立博(1974-)，女，碩士，講師，主要從事營養(yǎng)與疾病研究。

〔2011-01-13收稿 2011-04-08修回〕

(編輯 張 慧)