五味子乙素抗H2 O2誘導PC12細胞凋亡的機制

李先偉 楊解人 (皖南醫學院藥理學教研室，安徽 蕪湖 241001)

五味子乙素抗H2O2誘導PC12細胞凋亡的機制

李先偉 楊解人 (皖南醫學院藥理學教研室，安徽 蕪湖 241001)

目的 探討五味子乙素(Sch B)抗H2O2誘導PC12細胞凋亡的影響及機制。方法 在H2O2誘導PC12細胞凋亡模型的基礎上，采用MTT比色法分析細胞存活率;Hochest33258熒光染色法和流式細胞儀檢測細胞凋亡情況;DCFH-DA法檢測細胞內活性氧(ROS)水平;Real Time PCR和Western印跡檢測p53基因mRNA和蛋白的表達。結果 不同劑量Sch B處理PC12細胞48 h后，可劑量依賴性對抗H2O2引起的細胞凋亡，提高細胞存活率，減輕H2O2導致的細胞核固縮、聚集和碎裂，降低細胞內ROS的含量，抑制p53基因mRNA和蛋白的表達。結論 Sch B可劑量依賴性對抗H2O2誘導的PC12細胞凋亡，其機制可能與其抗氧化、下調促凋亡基因p53的表達等有關。

五味子乙素;PC12細胞;凋亡;活性氧;p53

五味子乙素(Sch B)是從中藥五味子分離得到的有效成分之一，體內外研究表明Sch B具有明顯清除自由基和抑制脂質過氧化作用〔1，2〕，提高大鼠腦細胞線粒體抗氧化能力和保護大鼠腦缺血-再灌注損傷〔3〕，但其神經保護作用的機制目前還不清楚。PC12細胞由于其本身的特性常用作神經元模型。本研究采用H2O2誘導PC12細胞凋亡，觀察Sch B對凋亡的PC12細胞內活性氧(ROS)含量、細胞周期進程、p53基因表達等方面的影響，探討Sch B抗H2O2誘導PC12細胞凋亡的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Sch B，純度98%(成都思科華生物技術有限公司);PC12細胞株(中國科學院上海細胞庫);DMEM培養基(北京索萊寶);馬血清、胎牛血清(Hyclone);噻唑藍(MTT);細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒、細胞凋亡Hochest33258染色試劑盒、DCFH-DA-ROS檢測試劑盒(杭州碧云天);Power SYBR Green PCR Master Mix(大連寶生物工程有限公司)，引物由上海生物工程有限公司合成;山羊抗鼠p53(一抗)、辣根過氧化物酶(HRP)抗羊(二抗)(Santa Cruz)、增強型化學發光試劑(ECL)顯色劑(武漢博士德公司);其余試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及誘導分化 PC12細胞置于含10%馬血清、5%胎牛血清、100 U/m l青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM培養液中，在37℃、5%CO2培養箱中培養。待生長良好時即細胞均處于對數生長期，且細胞存活率均在95%以上時(一般為細胞傳代后的1～2 d)。加神經生成因子(NGF)致終濃度為100μg/L繼續培養5～7 d。倒置顯微鏡下觀察細胞形態并計數，分化成為神經元樣細胞后，繼續進行下一步實驗。

1.2.2 實驗分組與處理 PC12細胞培養24 h，用不同終濃度的 Sch B(5、10、20、40 μmol/L)預處理 60 min，再加 H2O260μmol/L繼續培養48 h，收集細胞進行實驗。每次實驗均設①正常對照組:予2%馬血清、1%胎牛血清培養基;②H2O2刺激組:予2%馬血清、1%胎牛血清培養基+H2O2(60μmol/L);③各濃度 Sch B(5、10、20、40 μmol/L)干預組:分別予 Sch B 培養60 min后，再予H2O2(60μmol/L)繼續培養48 h。每組設3個平行組。

1.2.3 MTT檢測細胞存活率 收集對數期PC12細胞，調整細胞密度為(2×105～5×105)。細胞接種于96孔培養板中，每組設8個平行孔，培養24 h后，按以上分組再處理48 h，終止培養前每孔加入MTT 10μl，繼續培養4 h，棄去培養液，加入DMSO 150μl/孔，置搖床上低速振蕩10～15 min，酶標儀檢測各組細胞在492 nm的OD值，以對照組細胞存活率為100%，計算其他各組細胞存活率。細胞存活率(%)=實驗孔OD/對照孔OD×100%。以上實驗重復3次。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期 收集對數期PC12細胞，調整細胞密度為(2×105～5×105)。細胞接種于6孔培養板中，培養24 h后，分別加入上述處理因素后繼續培養48 h。收集細胞，將細胞制成單細胞懸液，4℃預冷(PBS)洗滌 2次;1 000 r/min離心5 min，棄上清，4℃預冷的70%乙醇固定，4℃過夜;1 000 r/min離心5 min，棄上清，4℃預冷PBS 1 ml重懸細胞，每管細胞加入0.5 m l碘化丙啶(PI)(濃度為50 mg/ml)染色液，37℃避光孵育30 min后即可進行流式細胞分析。以上實驗重復3次。

1.2.5 細胞凋亡的細胞核形態學檢測 收集對數期PC12細胞，調整細胞后接種于12孔培養板中，培養24 h后，分別加入上述處理因素后繼續培養48 h。吸盡培養液，加入0.5 ml固定液，4℃過夜。用PBS洗兩遍后加入0.5 ml Hoechst33258染色液，染色5 min。去染色液，滴一滴抗熒光淬滅封片液后用熒光顯微鏡觀察并拍照。以上實驗重復3次。

1.2.6 細胞內ROS水平檢測 PC12細胞接種于12孔培養板中，培養24 h后，分別加入上述處理因素后孵育48 h后進行實驗。棄取培養液，PBS洗3次，然后每孔加入10μmol/L的DCFH-DA熒光探針1 ml，37℃避光孵育20 min，用無血清細胞培養液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。再加入1 m l含血清培養液，30 min后用流式細胞儀(488 nm激發波長，525 nm發射波長)測定細胞熒光強度，計算ROS的含量。以上實驗重復3次。

1.2.7 Real Time PCR檢測p53基因mRNA的表達 PC12細胞接種于12孔培養板中，培養24 h后，分別加入上述處理因素孵育48 h后進行實驗。用Trizol等試劑提取總RNA后，按照逆轉錄試劑盒操作步驟進行反轉錄(RT)反應。所得cDNA在實時熒光定量PCR儀上進行反應。于每次擴增的同時設置無cDNA的陰性對照。將PCR產物做熔解曲線，以證實以上PCR反應產物特異性良好。用7300 System SDS Software相對定量分析數據，統計ΔΔCt值以比較各組mRNA的表達。引物如下:(GAPDH)上游引物:5'-GGTGAAGGTCGGTGTCAACG-3'，下游引物:5'-CAGCCCTTCCACGATGCCAA-3'，擴增產物517 bp;p53:上游引物:5'-TTTGAGGTTCGTGTTTGTGC-3'，下游引物:5'-CCACGGATCTTAAGGGTGAA-3'，擴增產物 194 bp。

1.2.8 Western印跡檢測p53蛋白表達 低溫提取蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。每孔上樣50μg蛋白，12%SDS-PAGE分離樣品，轉膜，封閉，將膜與溶于封閉液中的一抗(兔抗大鼠p53多克隆抗體1∶400)，4℃過夜。洗膜，將膜浸入以1∶2 000稀釋的二抗稀釋液中，室溫孵育1 h。加入ECL試劑，曝光，顯影，定影，分析。

1.3 統計學分析 應用SPSS16.0統計軟件，數據用±s表示。用單因素方差分析進行統計學處理，組間差異采用Student-Newman-Keuls多重比較t檢驗。

2 結果

2.1 PC12細胞誘導分化 未分化的PC12細胞呈圓形，細胞透亮，體積較小，經NGF誘導7 d后，可見PC12細胞胞體飽滿，胞漿透亮，核仁大而明顯，胞體周圍有明顯折光，立體感強，神經元突起較長，且相互聯結成網。表明PC12細胞誘導分化成功，可以用于后續實驗。見圖1。

圖1 PC12細胞誘導分化

2.2 Sch B對H2O2誘導的細胞損傷具有保護作用 H2O2可以明顯誘導PC12的損傷，與對照組相比，細胞存活率顯著降低(P＜0.05)。而不同濃度Sch B可顯著提高PC12細胞存活率，與H2O2組相比(P＜0.05)，且這種保護作用呈明顯的劑量依賴性。見表1。

2.3 Sch B對PC12細胞周期的影響 流式細胞術結果顯示H2O2(60μmol/L)刺激PC12細胞48 h后，細胞周期中G1期細胞所占百分率較對照組顯著增加(P＜0.05)，而S、G2期細胞所占百分率均相應減少(P＜0.05);在此基礎上，Sch B處理能使G1期細胞百分率減少和S、G2期期細胞百分率增加(P＜0.05)，并且呈劑量依賴性。見表2。

表1 Sch B對PC12細胞活力、ROS水平、p53 m RNA和蛋白表達的影響(±s，n=10)

表1 Sch B對PC12細胞活力、ROS水平、p53 m RNA和蛋白表達的影響(±s，n=10)

與對照組比較:1)P＜0.05;與H2O2處理組比較:2)P＜0.05

蛋白對照組 － 100.00±0.00 0.78±0.05 0.153±0.01 4.87±0.32組別 劑量(μmol/L) 細胞活力(%) ROS p53 mRNA p53 H2O2組 0 38.05±3.431) 8.71±0.521) 1.284±0.151) 8.89±0.741)Sch B組 5 43.49±4.861)2) 7.46±0.411)2) 1.083±0.111)2) 7.98±0.691)2)Sch B組 10 49.73±5.011)2) 6.04±0.281)2) 0.895±0.091)2) 7.65±0.631)2)Sch B組 20 54.36±5.451)2) 5.45±0.551)2) 0.764±0.081)2) 6.21±0.581)2)Sch B組 40 63.67±5.821)2) 4.49±0.311)2) 0.616±0.071)2) 5.43±0.472)

表2 Sch B對PC12細胞周期的影響(±s，n=6)

表2 Sch B對PC12細胞周期的影響(±s，n=6)

與對照組比較:1)P﹤0.05;與H2O2處理組比較:2)P﹤0.05

組別 劑量(μmol/L)細胞周期比例(%)G1 S G2對照組 － 26.94±2.52 44.64±4.68 30.50±2.17 H2O2 0 73.44±7.841) 15.67±1.571) 10.82±1.291)Sch B 5 64.93±6.751)2) 19.62±2.011)2) 15.50±1.721)2)Sch B 10 53.22±5.481)2) 27.67±2.831)2) 19.23±2.161)2)Sch B 20 44.54±4.961)2) 31.81±3.271)2) 23.75±2.451)2)Sch B 40 28.17±2.892) 43.18±4.542) 28.82±3.022)

2.4 PC12細胞凋亡的細胞核形態學改變 Hoechst 33258是一種親脂性物質，可跨膜進入細胞與DNA特異性結合，紫外光激發時發出明亮的藍色熒光。正常細胞核出現彌漫均勻的低密度熒光;凋亡細胞核呈濃染致密的固縮形態或者顆粒狀熒光。有圖2A可見對照組中正常細胞染色質分布均勻，為彌散均勻的低強度熒光。而H2O2處理組，PC12細胞呈現明顯的凋亡特征:大量的細胞核呈致密的固縮狀或顆粒狀，細胞核聚集或碎裂比較明顯，且有少量凋亡小體(圖2B)。而Sch B處理組PC12細胞的凋亡程度明顯輕于H2O2處理組。隨著劑量的增加，凋亡的程度越來越輕(圖2C、2D、2E、2F)。

2.5 Sch B對PC12細胞ROS水平的影響 DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內后，可以被細胞內的酯酶水解生成二氯熒光黃(DCFH)。細胞內的ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF，檢測DCF的熒光就可以知道細胞內ROS的水平。流式細胞儀檢測結果顯示對照組細胞內熒光強度為0.73±0.078，表明細胞內 ROS水平較低，而H2O2組細胞內熒光強度為8.91±0.778，表明細胞內ROS水平明顯升高。而Sch B處理組細胞內熒光強度顯著降低(P＜0.05)，并且呈劑量依賴性。見表1。

圖2 Sch B作用于PC12細胞后Hoechst33258核染色結果

2.6 Sch B對PC12細胞p53基因mRNA表達的影響 與對照組比較，H2O2處理48 h后，p53 mRNA的表達顯著升高(P＜0.05)，提示H2O2能促進PC12細胞p53 mRNA表達。而Sch B可明顯抑制p53 mRNA表達(P＜0.05)，抑制效應具有顯著的劑量依賴性見表1。目的基因p53和內參基因GAPDH的PCR產物通過熔解曲線分析發現均只有一個峰，說明在該反應條件下，各基因的擴增產物具有特異性。

2.7 Sch B對PC12細胞p53蛋白表達的影響 Western印跡結果顯示，與對照組比較，H2O2組p53蛋白條帶明顯變粗，提示H2O2能促進PC12細胞p53蛋白的表達。用濃度為5、10、20、40μmol/L的Sch B處理48 h后，p53蛋白條帶逐漸變細，表明SHC可劑量依賴性的抑制p53蛋白的表達(圖3)。圖像灰度分析結果顯示，隨著藥物濃度的增加，p53蛋白的表達顯著降低見表1。

圖3 Sch B對PC12細胞p53蛋白表達的影響

3 討論

研究表明，大量的氧自由基在體內堆積可引起細胞毒性，造成生物學大分子如脂質、蛋白和DNA的損傷。由于腦神經細胞膜富含多不飽和脂肪酸，其氧代謝率極高，抗氧化能力差，因此腦組織更易遭受自由基的損傷。H2O2是和氧化應激反應密切相關的ROS之一，它易穿過細胞膜與細胞內的金屬離子作用產生羥自由(·OH)，攻擊細胞內的成分如脂質、蛋白及DNA等，引起廣泛的氧化損傷。本實驗用H2O2建立神經損傷模型，使PC12細胞暴露于H2O2中，結果顯示細胞存活率下降，細胞內ROS顯示升高，細胞核固縮、聚集和碎裂。這證實H2O2可以誘導體外培養的PC12細胞發生凋亡。

Sch B是從中藥五味子中分離的主要活性成分之一，大量研究表明Sch B具有天然的抗氧化性質〔4〕。研究證實，Sch B能夠降低缺血再灌注損傷產生的心肌、腦細胞線粒體脂質過氧化物的含量，改善線粒體膜的流動性，并能夠清除自由基〔5〕。Sch B還具有增加肝臟微粒體還原型谷胱甘肽(GSH)和GSH還原酶活性，具有抗氧化作用〔6〕。王蕾等人研究表明Sch B可以有效減輕H2O2對神經細胞的氧化損傷〔7〕。本研究表明，Sch B可劑量依賴性對抗H2O2引起的PC12細胞凋亡，提高細胞存活率，減輕H2O2導致的細胞核固縮、聚集和碎裂，降低細胞內ROS的含量。p53基因是一種最常見的促凋亡基因，可使細胞的增殖停滯于G1期，是細胞周期阻滯和細胞凋亡的關鍵介質〔8〕。本實驗中，H2O2誘導 PC12細胞 ROS含量明顯升高，ROS可以引起氧化應激，促使p53基因mRNA和蛋白的表達升高，誘導PC12細胞凋亡。而Sch B可抑制ROS的產生，降低p53基因mRNA和蛋白的表達，減輕PC12細胞的凋亡，起到保護效應。

總之，本實驗利用培養PC12細胞，觀察了Sch B對H2O2誘導PC12細胞凋亡的影響。結果表明，H2O2可以誘導PC12細胞凋亡，而Sch B能劑量依賴性的抑制H2O2誘導的PC12細胞凋亡，同時抑制p53基因的表達。由于氧化應激引起的神經元凋亡作用可能存在其他復雜的病理機制，Sch B如何作用于p53基因目前還不清楚，而p53基因的表達受多種因素的影響。因此，Sch B下調p53基因mRNA和蛋白的表達，保護神經元的作用機制尚需進一步研究。

1 Wang L，Nishida H，Ogawa Y，et al.Prevention of oxidative injury in PC12 cells by a traditional Chinesemedicine，Shengmai San as a model of an tioxidant-based composite formula〔J〕.Biol Pharm Bull，2003;26(7):1000-4.

2 Ichikawa H，Wang L，Konishi T.Prevention of cerebral oxidative injury by post-ischemic intravenous administration of Shengmai San〔J〕.Am JChin Med，2006;34(4):591-600.

3 Chen N，Chiu PY，Ko KM.Schisandrin B enhances cerebralmitochondrial antioxidant status and structural integrity，and protects against cerebral ischemia/reperfusion injury in rats〔J〕.Biol Pharm Bull，2008;31(7):1387-91.

4 王 蕾，龔慕辛，孔慶利.五味子及有效成分抗氧化作用的實驗研究概況〔J〕.中華實用中西醫雜志，2005;18(17):920-1.

5 Chen N，Ko M.Schisandrin B-induced glutathione antioxidant response and cardioprotection aremediated by reactive oxidant species production in rat hearts〔J〕.Biol Pharm Bull，2010;33(5):825-29.

6 王文燕，陳建光.五味子的藥理作用和開發研究〔J〕.北華大學學報自然科學版，2007;8(2):128-33.

7 王 蕾，唐 勇，黃 山.五味子乙素和五味子醇甲對PC 12細胞氧化損傷的保護作用〔J〕.中國臨床康復，2006;10(47):64-7.

8 Hofseth LJ，Hussain SP，Harris CC.P53:25 years after its discovery〔J〕.Trends Pharmacol Sci，2004;25(4):177-81.

Effects of Schisandrin B on apoptosis of PC12 cells induced by H2O2and itsmechanism

LIXian-W ei，YANG Jie-Ren.
Department of Pharmacology，W annan M edical College，W uhu 241001，Anhui，China

Objective To study the effect of Schisandrin(Sch B)on apoptosis of PC12 cells induced by H2O2and itsmechanism.M ethods Based on themodel of apoptosis of PC12 cells induced by H2O2，cell survival rate was evaluated by MTT assay，and apoptosis was analyzed by Hoechst33258 fluorescence staining and flow cytometer.The DCFH-DA fluorescence stainingwas used to determine the level of reactive oxygen species(ROS)in PC12 cells.The expression ofmRNA and protein for p53 gene were tested by real time PCR and Western blot.Results Treatmentwith different concentration of Sch B(5～40μmol/L)for 48 h increased the survival rate of PC12 cells in a dose-dependent fashion，Sch B prevented the PC12 cells nuclei from shrinkage，condensation and cleavage induced by H2O2.Sch B decreased the level of ROS and the expression of p53 mRNA and p53 protein in the PC12 cells.Conclusions Sch B can prevent apoptosis of PC12 cells by H2O2in a dose-dependent fashion，which is likely related to antioxidation and decreasing p53 gene expression.

Schisandrin B;PC12 cells;Apoptosis;Reactive oxygen species;p53

R392

A

1005-9202(2011)12-2244-04

皖南醫學院中青年科研基金項目(No.WK200925)

楊解人(1955-)，女，教授，碩士生導師，主要從事心血管藥理學研究。

李先偉(1979-)，男，講師，在讀博士，主要從事心血管藥理和分子藥理研究。

〔2010-07-15收稿 2011-01-12修回〕

(編輯 袁左鳴/曹夢園)