腫瘤全抗原致敏的惡性胸水中腫瘤浸潤免疫細胞的體外抗癌作用

黃 艷 王紅陽 李球兵 劉信榮 喻昌利 劉 颯

(華北煤炭醫學院附屬醫院呼吸內科，河北 唐山 063000)

腫瘤全抗原致敏的惡性胸水中腫瘤浸潤免疫細胞的體外抗癌作用

黃 艷 王紅陽 李球兵 劉信榮 喻昌利 劉 颯

(華北煤炭醫學院附屬醫院呼吸內科，河北 唐山 063000)

目的 觀察惡性胸水中腫瘤浸潤免疫細胞中浸潤樹突細胞(TIDC)和腫瘤浸潤T淋巴細胞(TIL)經過IL-2活化負載CALU-6腺癌細胞腫瘤全抗原后的體外抗癌作用。方法 分離惡性胸水單個核細胞(PEMCs)，采用兩步貼壁法獲得非貼壁細胞，TIDC及TIL是其主要功能細胞成分。SP法檢測TIL亞群的數量及免疫功能，SP法S-100蛋白染色檢測TIDC。IL-2活化腫瘤浸潤免疫細胞并負載CALU-6腫瘤細胞全抗原，MTT法分別檢測活化的免疫細胞對CALU-6和GLC-82腺癌細胞的體外殺傷作用。結果 IL-2活化培養7 d后TIDC和TIL數量明顯增加。惡性胸水腫瘤浸潤免疫細胞(主要包括TIL和TIDC)經過CALU-6腺癌細胞腫瘤全抗原負載后，相同濃度對于CALU-6腺癌細胞殺傷明顯，而對于GLC-82腺癌細胞無明顯殺傷作用，兩者比較差異具有顯著意義(P＜0.01)。結論 IL-2同時活化腫瘤微環境中TIL及TIDC，使其由一種無功能或功能低下狀態恢復免疫監視功能，有效地負載腫瘤抗原，協同TIL等其他免疫細胞可以有效殺傷腫瘤細胞?；罨瘣盒孕厮庖呒毎泽w回輸治療惡性胸水具有臨床應用前景。

腫瘤浸潤樹突細胞;腫瘤浸潤性淋巴細胞;惡性胸水

惡性胸水臨床上常用的治療方法是抽取胸腔積液，進行胸腔內化療或生物治療。惡性胸腔積液細胞成分豐富，含有多種免疫細胞，但是通常臨床棄之不用。目前認為腫瘤微環境中抗原提呈細胞及效應細胞是腫瘤微環境的關鍵細胞，可以發揮免疫監視及清除癌細胞的作用。對腫瘤浸潤樹突細胞(TIDC)的研究證實，樹突細胞(Dendritic cells，DCs)是腫瘤微環境中的主要抗原提呈細胞，但是無功能或功能低下〔1〕，有關惡性胸水腫瘤微環境的TIDC研究較少。目前認為腫瘤浸潤T淋巴細胞(TIL)主要源于T淋巴細胞，在白細胞介素-2(IL-2)作用下可增殖、分化為細胞毒性T細胞(CTL)。本文選擇在體外用IL-2活化惡性胸水免疫細胞，主要針對TIL和TIDC，觀察負載腫瘤全抗原后其對腫瘤細胞的體外殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料 多種氨基酸培養基(RPMI1640，美國Life Technologies公司)。淋巴細胞分離液(Ficoll-Hypaque液，上海試劑二廠)，IL-2(北京雙鷺生物工程制品廠)，AB血清(中國醫學科學院天津血液學研究所)。肝素抗凝試劑、人外周血T細胞亞群自動視野檢測(SAP)法檢測試劑盒、S-100蛋白SP法檢測試劑盒(北京中山生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料 選取2003年3月至2007年8月我院診治的100例惡性胸水患者，男50例，女50例。所有病例經胸片、CT及病理學診斷和/或細胞學檢查證實為晚期惡性肺腫瘤合并胸膜轉移致胸腔積液，均為肺癌患者，但血性胸水患者不作為研究對象。

1.2.2 操作方法 無菌操作抽取患者胸水500 m l，并將其引流進含有肝素(10 U/ml)的無菌鹽水瓶內，50 m l離心管分裝胸水，1 000 r/min，20℃離心10 min。棄上清，Hanks液洗2遍。取10只10 ml離心管各加淋巴細胞分離液3.5 ml，以1∶1的比例加入漢斯平衡鹽溶液(HBSS)懸浮細胞。2 000 r/min，20℃離心20 min。吸取白膜層細胞轉移至 10 ml離心管。1 000 r/min離心10 min。棄去上清，含滅活補體的10%人AB型血清的RPMI1640培養基洗2遍。調整細胞濃度為106/ml，接種于6孔板中，每孔加2 ml，置體積分數為0.05的CO2、37℃溫箱中培養2～3 h。輕輕吸取非貼壁細胞，洗去殘余懸浮細胞，獲得先貼壁細胞，所有懸浮細胞共同轉移至另一個6孔板中再貼壁20 h，再次吸取非貼壁細胞(單核細胞為主)(包括TIDC和TIL)。非貼壁細胞中加入500 U/m l IL-2，每2 d傳代1次，同時補充IL-2，37℃ 5%CO2溫箱繼續培養，相差顯微鏡下觀察細胞形態。臺盼藍計數細胞并檢測細胞活性。細胞培養前后SP法檢測T細胞亞群免疫功能，SP法檢測S-100蛋白陽性細胞。SP法檢測S-100蛋白陽性細胞免疫組化二氨基聯苯胺(DAB)染色判定標準:光鏡下可見胞質及胞膜出現棕黃色，DCs為胞質著色，單核/巨噬細胞染色位于細胞膜。

1.2.3 制備腫瘤細胞全抗原 取對數生長期常規培養的CALU-6腺癌細胞，調整細胞濃度為1×107/ml，反復低滲凍融4次，高速離心(10 000 r/min)，并收集上清過濾除菌作為腫瘤細胞全抗原備用。

1.2.4 細胞培養 細胞培養第7天，107/m l細胞濃度的腫瘤細胞全抗原分別與非貼壁細胞共同孵育24 h，參照Cole方法，調整腺癌細胞CALU-6和GLC-82的細胞濃度為1×105/ml，配制成懸液，加入96孔平底培養板中培養24 h使細胞恢復增殖，胸水腫瘤浸潤免疫細胞以1∶10，1∶50，1∶100與兩種腺癌細胞混合培養48 h以上，再加入噻唑藍(MTT)試劑50 ng/m l，繼續培養4～6 h，去除上清液加入10%二甲基亞砜200μl，用酶標比色計(波長540 nm)測OD值，計算細胞殺傷率。腫瘤浸潤免疫細胞殺傷活性(%)=〔1－(實驗組OD值－單獨效應孔OD值)/單獨靶細胞孔OD值〕×100%。

1.3 統計學分析 應用SPSS13.0統計軟件進行分析，數據以±s表示，采用t檢驗。

2 結果

2.1 SP法檢測S-100蛋白陽性細胞 惡性胸水存在少量S-100陽性DCs，為圓形或具有短而鈍突起，是免疫功能低下的表現。IL-2活化后細胞形態變化，胞質出現分枝狀突起，形似樹突狀的DCs，提示恢復抗原提呈功能。見圖1。

圖1 光鏡下樹突細胞形態

2.2 SP法檢測T細胞亞群變化情況 400倍光鏡下連續觀察10個視野，并對每個視野CD3、CD4和CD8陽性細胞計數，結果發現T細胞亞群細胞數量明顯增加，細胞體積較前增大。分別對CD3、CD4和CD8進行配對樣本t檢驗，誘導前后T淋巴細胞表型比較，CD3，CD4均有明顯增多，t值為 －18.59，－43.34，P＜0.01;CD8比例較前減少，差異有顯著性，t值為21.83，P＜0.01。T淋巴細胞增多表現為CD4細胞增多，提示抗原提呈細胞介導的免疫功能上調。見表1。

表1 IL-2活化后惡性胸水中T淋巴細胞表型比較(±s，%)

表1 IL-2活化后惡性胸水中T淋巴細胞表型比較(±s，%)

與活化前比較:1)P＜0.01

組別 n CD3 CD4 CD8活化前100 47.85±4.73 15.47±3.05 32.3±5.73活化后 100 58.41±6.111) 39.26±4.861) 19.15±4.771)

圖2 光鏡下CTL溶解腫瘤細胞(×400)

2.3 腫瘤抗原負載后T細胞亞群變化情況 見表2，圖2。腫瘤全抗原負載的腫瘤浸潤免疫細胞對于GLC-82細胞殺傷活性較低，t值為33.55，兩者比較差異具有顯著意義(P＜0.01)。CALU-6細胞作為腫瘤抗原負載惡性胸水共同孵育24 h后，可見到較多活化的CTL溶解腫瘤細胞。

表2 惡性胸水腫瘤浸潤免疫細胞殺傷活性比較(±s，%)

表2 惡性胸水腫瘤浸潤免疫細胞殺傷活性比較(±s，%)

與GLC-82組比較:1)P＜0.01

組別 n 100 31.38±3.42 36.55±6.18 CALU-6組 100 51.71±5.071) 82.12±5.291)1∶50 1∶100 GLC-82組

3 討論

肺癌合并惡性胸水臨床較常見，其中以胸膜轉移為常見原因，這些轉移灶從生物學角度看具有異質性，每個病灶對抗腫瘤藥物的敏感性也存在異質性，因此單純化療除去所有轉移灶并不可能?？乖岢始毎麑⒛[瘤抗原有效地提呈給T淋巴細胞，激活腫瘤抗原特異性CTL對腫瘤細胞的殺傷作用是特異性抗腫瘤免疫的關鍵環節〔2，3〕。DC是體內功能最強的專職抗原提呈細胞，僅占外周血單個核細胞總數的0.5% ～1.0%。針對癌腫瘤微環境DCs數量、功能的研究鮮見報道。TIDC是腫瘤微環境中的主要抗原提呈細胞，可能是一種無功能或功能低下的DCs。腫瘤細胞在腫瘤局部分泌的免疫抑制因子可能是導致TIDC功能低下的原因之一，其可能抑制免疫細胞的抗腫瘤免疫應答，因此研究TIDC對了解腫瘤免疫逃避機制具有重要意義〔4〕。由于晚期癌癥患者全身免疫功能低下，導致了癌性胸水中的TIL處于免疫抑制狀態。目前，TIL體外活化后特異性及細胞殺傷活性等已得到臨床證實，來自自體腫瘤細胞的TIL對自體腫瘤具有強大的細胞毒作用，對自體正常組織無殺傷性。隨著腫瘤免疫學研究的不斷深入，提出了“腫瘤微環境”(tumor environment)的概念，由于惡性腫瘤在患者體內生長時能分泌免疫抑制因子，抑制免疫細胞的抗腫瘤免疫應答。因此，如何解除腫瘤細胞的免疫抑制作用，優化機體特異性抗腫瘤免疫的微環境和提高腫瘤患者機體自身的抗腫瘤免疫應答是預防及治療癌細胞擴散和轉移過程一個重要問題〔5〕。以往的研究發現，IL-2基因修飾的DCs免疫治療，能優化腫瘤宿主體內抗原提呈的微環境;腔內直接注入TIL，對局部抗腫瘤免疫應答的微環境起到了優化和增強作用，能有效地抑制晚期癌癥患者胸水中癌細胞的增長。本文發現IL-2活化TIL的同時，使胸水中的無功能TIDC轉變為成熟DC，腫瘤抗原致敏的TIL和TIDC有特異性殺傷作用。

本研究結果顯示惡性胸水中的TIDC數量極少，經過IL-2活化，T細胞免疫功能明顯上調，且對于腫瘤抗原具有特異性殺傷作用。本研究結果為惡性胸水的臨床治療提供了可靠的實驗依據，在臨床治療中將有廣闊的應用前景。

1 Michael R.Dendritic cells presenting tumor antigen〔J〕.Cancer Immunol，1996;43(3):158-64.

2 Sallusto F，Lanzavecchia A.Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells ismaintained by granulocyte〔J〕.JExp Med，1994;179(14):1109-18.

3 Canque B，Rosenzwaijg M，Camus S，et al.The effect of in vitro human immunodeficiency virus infection on dentritic-cell differentiation and function〔J〕.JBlood，1996;88(11):4215-28.

4 Alzona MT，Smith S，van Epps DC，et al.Macrophage colony-stimulating factor plus interleukin4 and down regulated by tumor necrosis factor alpha〔J〕.Blood，1996;88(suppl1):1090.

5 丘少鵬，陳輝熔，鄧春華，等.前列腺癌腫瘤微環境樹突狀細胞與T細胞免疫的關系〔J〕.中山醫科大學學報，2002;23(2):127-8，131.

R73

A

1005-9202(2011)12-2252-03

河北省衛生廳重點課題(No.04258)

王紅陽(1958-)，女，教授，碩士生導師，主任醫師，主要從事呼吸系統疑難急癥診治研究。

黃 艷(1976-)，女，碩士，主治醫師，主要從事肺癌基礎與臨床研究。

〔2011-03-22收稿 2011-04-02修回〕

(編輯 袁左鳴/徐 杰)